왜 drug-selection marker가 내 세포를 약물 내성으로 만들지 않는 것일까요?

Drug-selection gene이 효과를 내려면 일반적으로 낮거나 중간 정도의 발현만을 필요로 하지만, 어떤 경우에는 세포에 완전한 drug resistance를 주기 위해서는 불충분할 수 있습니다. 다음은 drug resistance가 결여된 가장 빈번한 원인들입니다.

Drug 양이 당신의 cell line에 비해 너무 많다

각기 다른 drug에 대한 반응은 cell line 마다 다양합니다. Cell line에 새로운 drug을 적용하기 전에, 항상 kill curve ('dose response curve' 라고도 함)를 생성하여, non-transfection 또는 non-transduction 세포를 효과적으로 죽이는 가장 낮은 drug 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 불필요하게 높은 농도의 drug을 사용하면 drug resistance gene을 발현하는 세포가 죽을 수 있으며, 심지어 저항성 세포의 건강도 해칠 수 있습니다. 어떤 세포는 특정 drug에 극도로 민감하며, 이 경우 다른 drug-selection marker를 사용하는 것을 고려해야 할 것입니다.

Drug-selection marker가 약한 promoter에 의해 발현됩니다.

일부 promoter는 원래 약하며 (예: UBC), drug-selection marker를 적게 발현하는 결과를 초래할 수 있습니다. 더 강력한 promoter (예: EF1A)를 사용하여 drug-selection marker의 발현을 증가시키는 것을 고려할 수 있습니다.

Drug-selection marker가 lentivirus 또는 MMLV를 통해 발현됩니다.

Retroviral 벡터 시스템 (예: lentivirus 또는 MMLV)의 경우 internal polyadenylation signals이 LTR 사이에 존재할 수 없으며, 이는 바이러스 패키징을 억제할 수 있습니다. 대신에 3' LTR에 single polyadenylation signal이 존재합니다. 그 결과, upstream promoter로부터의 전사는 upstream ORF의 끝을 지나 downstream promoters 및 ORF를 통해 지속되는 경우가 있습니다. 이는 종종 downstream ORF의 부분적 발현 억제로 이어집니다. Downstream ORF가 drug-selection marker일 때, 그 발현은 훨씬 줄어들 수 있다. 다음과 같이 마커 발현을 개선할 수 있습니다.

Regular plasmid, adenovirus 또는 AAV와 같은 다른 벡터 시스템을 사용하는 것을 고려해 볼 수 있습니다.

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Polycistron의 일부로 upstream 발현 카세트에 drug-selection marker를 발현하는 것을 고려해 봅니다. 2A linker를 사용하여 목적 유전자에 drug-selection marker를 연결할 수 있습니다. 그러나 이는 polycistron 내 다른 ORF의 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 여전히 약한 drug resistance를 야기할 수 있고, 벡터 제작의 비용과 시간을 증가시킬 수 있습니다.

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Drug-selection marker가 IRES의 downstream에 있습니다.

하나 이상의 IRES elements를 포함하는 polycistronic transcript에서 IRES의 downstream 유전자는 polycistron의 첫번째 유전자에 비해 훨씬 낮은 수준 (일반적으로 10~20%)으로 발현됩니다. 만약 drug-selection marker가 IRES의 downstream에서 발현된다면, 이러한 발현 감소는 drug resistance를 저하시킬 수 있습니다. Polycistron의 downstream 위치에서 drug-selection marker를 발현해야 하는 경우에는, IRES 대신 2A linker (e.g. P2A 또는 T2A)를 사용하는 것을 고려할 수 있습니다. 2A linker를 사용함으로써 polycistronic transcript의 downstream ORF는 upstream ORF와 유사한 수준(또는 다소 낮은 수준)으로 발현됩니다. 그러나, 2A는 또한 목적 유전자의 기능을 구성할 수 있는 리스크을 가지고 있다. 특히 2A linker의 cleavage는 upstream 단백질 C 말단에 추가로 짧은 펩타이드, downstream 단백질 N 말단에 추가로 proline을 남겨둡니다. 이것은 대부분의 실험에서 문제가 되지 않지만, 어떤 상황에서는 단백질 기능에 영향을 줄 수 있습니다.

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