CRISPR 게놈 편집 솔루션

CRISPR 시스템은 점점 더 다양한 응용 분야에 사용될 수 있으며, CRISPR 방식은 Cas 단백질과 guide RNA (gRNA)라는 2가지 기본 구성요소가 필요합니다. 가장 일반적으로 사용되는 Cas endonuclease는 Streptococcus pyogenes (a.k.a. SpCas9 또는 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화를 적용한 hCas9)에서 엔지니어링됩니다. 이는 타겟 사이트에 double-strand breaks (DSBs)을 생성할 수 있는 RNA-guided DNA nuclease입니다 (Figure 1). Cas9는 complementary gRNA에 의해 호스트 게놈의 타겟 사이트에 위치하며, gRNA가 Protospacer Adjacent Motif (PAM)에 바로 인접한 영역을 타겟으로 하도록 설계된 경우 DSB가 생성됩니다. PAM 서열은 사용되는 특정 Cas enzyme에 따라 달라집니다. SpCas9의 경우 PAM 서열은 NGG 또는 NAG입니다 (orange DNA in Figure 1).

Figure 1. 유전자 knockout이나 정확한 서열 변경을 생성하기 위한 CRISPR-induced DNA repair 메커니즘.

CRISPR 시스템에 의해 DSB가 생성되면, 세포는 DNA break을 복구하기 위해 non-homologous end joining (NHEJ) 경로를 활성화하는데, 이는 일반적으로 작은 random deletion이나 드물게는 insertion 및 base substitution을 초래합니다. 이러한 돌연변이가 단백질 코딩 영역을 손상시키면 (e.g. a deletion causing a frameshift), 이는 기능적 유전자 knockout으로 이어질 수 있습니다. Cas9와 함께 dual gRNA를 도입하여 2개의 DSB를 생성하고, 이를 통해 두 타겟 사이트 사이에 위치한 DNA fragment을 삭제하거나 (Figure 4), dual gRNA를 사용하여 두 개의 서로 다른 유전자를 동시에 타겟팅할 수 있습니다.

또한, 덜 효율적이지만, DNA template이 존재할 때 homology-directed repair (HDR) 경로를 통해 DSB를 복구할 수 있습니다. Donor DNA가 CRISPR 구성요소와 함께 도입되면, HDR은 타겟 게놈 DNA 서열을 donor 서열로 치환하여 point mutation 또는 knockin과 같은 정밀한 변경을 생성할 수 있습니다. Donor DNA template은 single-stranded oligo nucleotide (ssODN) 또는 dsDNA fragment (일반적으로 regular plasmid 또는 AAV에서 유래한 linearized DNA)일 수 있습니다. ssODN은 point mutation 또는 작은 tag insertion을 도입하는데 적합한 반면, dsDNA fragment는 외래 유전자의 표적화된 안정적 삽입과 같은 큰 단편 knockin을 도입하는데 사용됩니다.

또 다른 널리 사용되는 Cas9 variant인 Cas9 "nickase" (e.g. Cas9(D10A))는 DNA에 single-stranded cut을 생성합니다. Cas9 nickase가 단일 타겟 영역을 둘러싸고 있는 2개의 반대 가닥을 타겟으로 하는 2개의 gRNA와 함께 사용되는 경우, nickase는 각 가닥에 하나씩 2개의 single-stranded cut을 생성하여 Figure 2와 같이 타겟 영역 주변에 넓게 DSB를 생성합니다. Single nick은 일반적으로 높은 정확도로 복구되므로, 양쪽 2개의 오프셋 gRNA가 올바르게 결합하고 staggered DSB를 생성할 때만 효율적인 절단이 발생합니다. 따라서 이 double-nicking 전략은 많은 loci에서 높은 on-target 효율을 유지하는 동시에 off-target 활성을 획기적으로 감소시킵니다. 

Figure 2. 두 개의 gRNA를 사용한 nickase 활성.

촉매적으로 비활성 형태인 Cas9(dCas9)는 다양한 transcriptional complex와 결합하여 endogenous genomic loci에 대한 CRISPR 매개 transcription을 조절할 수 있습니다. CRISPR 매개 유전자 조절은 크로마틴의 regulatory element를 테스트, 타겟 세포의 재프로그래밍, 또는 증식과 분화를 유도하는 유전자를 확인하기 위한 whole genome 스크리닝 등 다양한 응용 분야에 사용될 수 있습니다.

유전자 transcription을 활성화하기 위해 (CRISPRa), SAM (Synergistic Activation Mediator) 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 dCas9/VP64 fusion protein, MS2/P65/HSF1 helper complex, 그리고 modified gRNA (msgRNA)의 세 가지 구성요소를 활용합니다. dCas9 단백질은 synthetic transcriptional activator인 VP64와 설계되었으며, gRNA는 NF-kB (p65)와 HSF1의 transactivation domain으로 구성된 MS2 complex를 모집하는 MS2 aptamer를 포함하도록 변형되었습니다. dCas9/VP64와 MS2/P65/HSF1 complex는 함께 시너지 효과를 발휘하여 endogenous transcriptional machinery와 cofactor를 모집하여 타겟 유전자 발현을 활성화합니다 (Figure 5). VectorBuilder는 SAM 시스템 외에도 HSF1의 transactivation domain을 Epstein-Barr virus R transactivator로 대체한 dCas9/VP64-p65-Rta (VPR) 시스템을 제공합니다. dCas9/VPR 시스템은 더 높은 레벨의 내인성 활성화를 나타내는 것으로 보고되었지만, AAV에는 크기가 작은 dCas9/VP64가 더 적합합니다.

대조적으로, 타겟 유전자 transcription을 억제하기 위해 dCas9는 KRAB (Kruppel-associated box domain) 및 MeCP2와 같은 transcriptional repressor와 설계될 수 있습니다. dCas9/KRAB helper 벡터는 현재 두 가지 버전으로 제공됩니다. 기존 dCas9/KRAB 벡터와 개선된 dCas9/KRAB/MeCP2 입니다. dCas9/KRAB/MeCP2 버전은 DNA 타겟 사이트의 transcriptional repression 을 더욱 강력하게 하기 위해 bipartite repressor domain KRAB/MeCP2에 융합된 dCas9의 발현을 유도합니다. KRAB domain은 human transcription factor에서 흔히 발견되며, 현재 인간 게놈에서 확인된 강력한 transcriptional repressor 중 하나입니다. MeCP2 histone deacetylases를 모집하여 KRAB 매개 억제를 더욱 강화하여, chromatin condensation 및 epigenetic-mediated repression을 유발합니다. Figure 6과 같이, gRNA가 endogenous promoter 에 dCas9/KRAB/MeCP2를 모집하도록 ​​설계된 경우, transcription이 크게 억제됩니다.

CRISPR 매개 게놈 편집 또는 조절을 위해서는 타겟 세포가 Cas9과 타겟 사이트 특이적 gRNA를 공동 발현해야 합니다. 응용 분야와 관계없이 CRISPR 구성요소는 타겟 세포에 도입되어야 합니다. 특정 구성요소는 다음을 포함한 다양한 방법을 통해 transfection 또는 transduction 될 수 있습니다.

• gRNA & Cas9 plasmid
• gRNA & Cas9 바이러스 (i.e. lentivirus, AAV, adenovirus, etc.)
• gRNA & Cas9 mRNA 혼합물
• gRNA & Cas9 단백질로 구성된 미리 형성된 RNP

Figure 3은 다양한 CRISPR 전달 방법을 요약한 것이며 Figures 7, 8, 9, 10의 사례 연구는 각 전달 방법의 효과를 보여줍니다.

Figure 3. CRISPR 구성요소를 타겟 세포로 전달하는 일반적인 방법.

아래 표는 각 전달 방식의 주요 장점과 단점을 나열한 것으로, 실험에 가장 적합한 방식을 결정하는 데 참고 자료로 사용할 수 있습니다.

VectorBuilder의 온라인 CRISPR 벡터 디자인 툴은 human, mouse, rat에 최적화된 whole-genome gRNA 데이터베이스를 제공하여, 높은 타겟 효율로 CRISPR 벡터를 디자인할 수 있습니다. 또한, 더 많은 Cas 효소와 호스트 종을 포함하도록 gRNA 데이터베이스를 확장하고 있습니다. CRISPR library design (CLD)에 사용된 알고리즘을 따라 gRNA의 specificity 스코어를 계산합니다. 간단히 말해, 특정 종의 N(20)NGG 서열을 타겟팅하도록 의도된 gRNA에 대해, 해당 종의 게놈에서 타겟 서열과 3개 이하의 불일치를 갖는 모든 잠재적 off-target 사이트를 검색합니다. 이렇게 식별된 각 잠재적 off-target 사이트에 대해 하나의 off-target 스코어가 계산됩니다. 모든 off-target 사이트의 스코어를 총합적으로 사용되어 gRNA의 최종 specificity 스코어를 계산합니다. 이 스코어는 0에서 100 사이의 값을 가지며, 값이 높을수록 targeting specificity가 높음을 나타냅니다. Specificity 스코어는 이론적인 지표임을 유의하시기 바랍니다. 실제 targeting efficiency와 specificity는 스코어가 예측하는 것과 다를 수 있습니다. 스코어가 낮은 gRNA가 잘 작동할 수도 있습니다.

VectorBuilder 온라인 플랫폼에서 CRISPR 벡터를 디자인할 때, 데이터베이스에서 타겟 유전자를 검색할 수 있습니다. 유전자 이름을 입력하면 데이터베이스에서 타겟 유전자에 대한 모든 사용 가능한 gRNA 디자인에 대한 자세한 정보를 확인할 수 있습니다.

Figure 4. DNA fragment의 deletion 을 위해 dual gRNA를 사용하여 gRNA/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 방법을 이용한 homozygous knockout (KO) mutant 생성. (A) Editing  RNP를 타겟 유전자의 두 사이트가 있는 타겟 세포에 electroporation하여 13 kb 영역을 삭제하고, 단일 클론을 분리하여 스크리닝하였습니다. 후보군의 genotype은 PCR 및 Sanger 시퀀싱을 통해 검증했습니다. (B) P1부터 P4까지 4개 primer를 사용하여 3번의 PCR을 통해 KO clone과 WT clone을 구별하였습니다. (C) PCR 결과를 바탕으로 clone 1은 homozygous KO mutant로 검증되었으며, 이는 (D) 시퀀싱 결과를 통해서도 확인되었습니다.

Figure 5. 렌티바이러스 기반 CRISPRa에 의한 유전자 발현 up-regulation. SAM complex dCas9/VP64와 MS2/P65/HSF1을 안정적으로 발현하는 NIH3T3 세포에 msgRNA 발현 렌티바이러스를 transduction한 후 antibiotic selection을 하였습니다. (A) Transcriptional activation 활성 모식도. (B) Mouse Brn2 유전자의 promoter 영역을 타겟으로 하는 msgRNA 디자인. (C) Scramble 또는 타겟팅 msgRNA를 transduction하거나 무처리 대조군 (NC)을 적용한 NIH3T3 세포에서 Brn2의 상대적 유전자 발현을 qRT-PCR로 측정. Mean±SD, *P<0.05, ANOVA with Tukey’s post hoc test.

Figure 6. 렌티바이러스 기반 CRISPRi에 의한 유전자 발현 down-regulation. dCas9/KRAB/MeCP2 transcriptional repressor complex를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포에 gRNA 발현 렌티바이러스를 transduction한 후 antibiotic selection을 하였습니다. (A) Repressor complex 활성 모식도. (B) Human CXCR4 유전자의 promoter 영역을 타겟으로 하는 gRNA 디자인. (C) Scramble 또는 타겟팅 gRNA 또는 무처리 대조군 (NC)을 transduction한 Jurkat 세포에서 CXCR4 단백질 레벨을 Western blot으로 측정했습니다. (D) qRT-PCR로 측정한 상대적 CXCR4 유전자 발현. Mean±SD, ***P<0.001, ****P<0.0001, ANOVA with Tukey’s post hoc test. (E) 표면 발현된 CXCR4를 flow cytometry로 정량화했습니다. CXCR4는 monoclonal primary antibodies (Ab)와 fluorophore-conjugated secondary Ab로 표지되었습니다. 표지되지 않은 그리고 2차 항체만 존재하는 Jurkat 세포는 음성 대조군으로 사용되었습니다. (F) CXCR4 타겟팅 gRNA로 transduction된 세포 표면의 CXCR4 양은 scramble gRNA로 transduction된 세포에 비해 약 50% 감소했습니다. Mean±SD.

CRISPR 구성요소를 타겟 세포에 전달하는 데에는 여러 가지 방법이 있으며, 각 방법에는 고유한 장점과 한계가 있습니다.

1. gRNA & Cas9 plasmid
2. gRNA & Cas9 바이러스
3. gRNA & Cas9 mRNA 혼합물
4. gRNA & Cas9 단백질 RNP