Dual-gRNA CRISPR Libraries

VectorBuilder는 인간 및 마우스 세포에서 CRISPR 기반 전체 게놈 knockout 스크리닝을 위한 dual-gRNA lentivirus library를 제공한다. 가능하면 각 유전자는 별도의 벡터에서 4~6개의 서로 다른 gRNA 쌍에 의해 중복하여 타켓팅된다. 이러한 library는 genome-wide loss-of-function 스크리닝을 수행하기 위한 강력하고 가성비 높은 도구이다. 또한 고객의 타겟 유전자 리스트에 대한 custom pooled gRNA library를 설계하고 제작할 수 있다. 

Types of dual-gRNA CRISPR libraries offered 
  • Ready-to-use, pooled, lentivirus libraries targeting the entire human genome (20,048 human genes)
  • Ready-to-use, pooled, lentivirus libraries targeting the entire mouse genome (20,493 mouse genes)
  • Custom pooled gRNA libraries (available as E.coli stock, DNA or recombinant virus)

Ordering Information

Price and turnaround
Product name No. of genes No. of gRNA pairs Scale Catalog No. Price (USD) Turnaround
Human Whole-Genome Dual-gRNA Lentivirus Library 20,048 91,926

Medium

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1046fgb) $7,999
$3,999
10-20 days

Plus

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1046fgb) $16,999
$8,499
Mouse Whole-Genome Dual-gRNA Lentivirus Library 20,493 90,344

Medium

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1050kpm) $7,999
$3,999

Plus

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1050kpm) $16,999
$8,499

Click to view our custom library construction services if our premade dual-gRNA CRISPR libraries don’t meet your needs

Deconvolution service

CRISPR library 스크리닝을 수행한 후 NGS에 의한 gRNA hits을 확인하는 방법을 모르시나요? 고객의 genomic DNA를 VectorBuilder로 발송하면 NGS library를 준비하고, high-throughput sequencing을 수행하고, 데이터를 분석하여, 단 몇 주 만에 각 샘플에서 gRNA의 정확한 카운트를 제공한다.

Deconvolution 서비스의 경우 Send Design Request 로 문의사항을 보내주세요.

Technical Information

Product highlights View more

Unique dual-gRNA lentiviral vector design

상용화된 전체 게놈 dual-gRNA lentivirus library로, library의 각 lentivirus벡터에는 한쌍의 gRNA expression cassettes와 EGFP/puromycin dual marker cassette가 포함되어 있다 (Figure 1). 동일한 벡터에서 쌍을 이룬 gRNA는 벡터가 세포에 도입될 때 동시에 발현되어, 동일한 유전자에서 두개의 개별 부위를 타겟팅하여 두개의 CRISPR 절단 부위를 생성하고 knockout 스크리닝에 대한 큰 기능 손실을 초래한다. 각 벡터에 있는 두개의 gRNA는 두개의 서로 다른 U6 promoter (human U6 및 macaque U6) 및 두개의 서로 다른 gRNA 스캐폴드 (described in Nat Methods. 14:573 (2017))와 결합된다. 이는 두 gRNA cassette 사이의 원치 않는 재조합을 줄이고 library로 transduction된 세포에서 upstream 또는 downstream gRNA의 PCR 증폭 및 NGS가 가능하다.

Figure 1. Map of the dual-gRNA library vector.

Click to view fully annotated map and sequence of the dual gRNA library vector 

Whole genome and high-coverage targeting

인간 및 마우스 dual-gRNA lentivirus library는 각각 인간 유전자 20,048개와 마우스 유전자 20,493개를 타겟으로 한다. 평균적으로 각각의 유전자는 일련의 기준척도에 의해 선별된 4-6개의 상이한 gRNA 쌍에 의해 타겟팅되고, 다음을 포함한다. 1) off-target 효과를 최소화하기 위한 off-target 스코어, 2) 두 부위에 걸친 deletion이 유전자 기능의 상실로 이어질 가능성이 높은 것을 보장하기 위한 절단 부위의 위치, 3) 각 절단 부위의 국소 돌연변이보다는 절단 부위에 걸쳐 큰 deletion의 돌연변이로 편향시키는 절단 부위 사이의 거리, 4) knockout되는 전사체의 수를 최대화하기 위해 각 유전자에서 영향을 받는 대체 전사체의 수. 모든 gRNA 절단 부위는 엑손 내에 위치한다. 따라서 사이트 간에 큰 deletion이 생성되지 않더라도 절단 부위 내의 모든 국소 돌연변이 (일반적으로 작은 deletion)는 유전자 기능을 방해할 가능성이 있는 돌연변이를 생성할 수도 있다. 타겟 유전자 및 gRNA의 상세 리스트는 “Technical documents”에서 확인할 수 있다.

Validation of library quality by NGS

Dual-gRNA lentivirus CRISPR library는 NGS에 의해 검증되었고, 쌍을 이룬 두 gRNA가 완전히 시퀀싱되었다. 이는 전체 sequencing reads의 > 85 % 및 > 75 %가 각각 인간 및 마우스 library에 대해 디자인된 gRNA 쌍과 일치함을 보여준다. 또한 인간 및 마우스 library에 대해 디자인된 gRNA 쌍의 > 99 % 및 > 97 %가 각각 NGS에 의해 검출되었다. 따라서 두 library는 모두 낮은 오류율로 디자인된 gRNA 쌍에 대한 우수한 적용범위를 갖는다. 이는 현재 보고된 최고 품질의 dual-gRNA library이다.

High uniformity

두 library에서 gRNA 쌍의 representation이 매우 균일하다 (Figure 2).

Figure 2. Representation of gRNA pairs in different pooled libraries. gRNA read counts are normalized by NGS library size (10 million reads) and plotted in log2 scale.

Well-established lentiviral system and ready-to-use high-titer lentivirus

Pooled CRISPR library는 다양한 세포에서 매우 효율적인 발현 시스템인 3세대 lentivirus 벡터 시스템에서 발현된다. 이 lentivirus 벡터 시스템은 gRNA를 영구적이고 효율적이며 상대적으로 균일하게 세포에 도입할 수 있기 때문에 in vitro 유전자 스크리닝에 이상적이다. Pooled CRISPR library는 고기능 titer (>108 TU/ml)를 가진 바로 사용 가능한 lentivirus로 제공되어 바이러스 패키징 및 titer 측정 시간을 절약한다. 3세대 lentivirus 벡터 시스템은 자가복제 특징이 부족하여 생물학적 안전성을 향상시키는데 최적화되었다.

Dual marker expression for efficient and versatile selection or tracking of positively transduced cells

EGFP 및 puromycin resistance gene (Puro)의 이중 마커 발현 카세트가 lentivirus 벡터에서 발현되어 puromycin에 의한 양성 transduction된 세포의 선별 및 녹색 형광에 의한 시각적 추적이 가능하다 (Figure 3).

Figure 3. EGFP expression in 293T cells transduced with Human Whole Genome Dual-gRNA Lentivirus Library (MOI=10) after 4 days of puromycin selection (1.5 ug/ml). Left: bright field. Right: EGFP.

Workflow of pooled CRISPR library-mediated genetic screen View more

Pooled dual-gRNA lentivirus library를 사용하는 CRISPR/Cas9 스크리닝의 일반적인 워크플로우는 Figure 4에 나와 있다. 첫째, Cas9 발현 세포는 lentivirus library로 transduction되고 양성으로 transduction된 세포는 lentivirus 벡터에 운반된 마커 유전자에 의해 선택된다 (예: drug-selection 또는 fluorescence marker). 다음으로, 양성으로 transduction된 세포는 기준 집단과 실험 집단으로 분할된다. 그런 다음 실험 집단에 특정 선택적 압력 (예: drug treatment 또는 repeated passaging)을 적용하여 관심 표현형을 가진 세포를 식별한다. 스크리닝 전략에는 세가지 주요 유형이 있다. 1) 선택적 압력에 노출되었을 때 생존 세포에서 농축되거나 고갈된 gRNA를 검색하는 생존력 스크리닝; 2) 높거나 낮은 리포터 발현과 관련된 세포에서 늘어난 gRNA를 찾는 리포터 스크리닝 (예: 리포터 유전자 발현을 조절하는 transcription factor를 타겟팅하는 gRNA); 3) cell invasion, migration 등과 관련된 유전자에 영향을 미치는 gRNA를 확인하는 행동 스크리닝. 스크리닝 후 실험 세포와 기준 세포를 모두 채취한다. 기준 그룹과 비교하여 실험 그룹에서 농축되거나 고갈된 gRNA는 Sanger 시퀀싱 또는 NGS를 사용하여 확인한다. 농축되거나 고갈된 gRNA에 의해 이론적으로 타겟팅된 후보 유전자는 downstream 기능 연구를 통해 추가로 조사될 수 있다.

Figure 4. Workflow of CRISPR-based knockout screens employing pooled dual-gRNA lentivirus libraries. Adapted from Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012).

Technical documents View more

FAQ

What are the advantages of dual-gRNA libraries compared to single-gRNA libraries?

Dual-gRNA libraries are far more powerful than single-gRNA libraries for knockout screens because the introduction of large deletions by these libraries can have much higher efficiencies in generating loss-of-function mutations. Each CRISPR vector in a dual-gRNA library contains a pair of gRNAs targeting the same gene. When introduced into Cas9-expressing cells, each vector can produce two cuts on the same target gene. Attempts by cells to repair the broken ends of the two cut sites would typically lead to a large deletion spanning the two sites. The two cut sites are designed to flank a functionally important region of the target gene such that a deletion spanning them would most likely lead to the loss of gene function.

For CRISPR knockout screens, should I use 1-vector systems or 2-vector systems?

For typical knockout screens, a pooled CRISPR library can be constructed in the format of either 1-vector or 2-vector systems. In 1-vector systems, Cas9 or Cas9 variant is co-expressed with gRNA(s) from the same vector, while in 2-vector systems, Cas9 or Cas9 variant and the gRNA(s) are expressed from two separate vectors. Alternatively, in 2-vector systems, gRNA-expressing vectors can be introduced into cell lines that stably express Cas9. The advantages of using the 1-vector systems are that it avoids co-transfection/transduction of two different vectors into cells and it is not limited to the availability of a Cas9-expressing stable cell line. However, it is less versatile and can be less efficient in cloning and virus packaging than the 2-vector systems.

How is gRNA specificity score calculated?

VectorBuilder follows the algorithm developed in Feng Zhang’s lab to calculate specificity scores for gRNAs. Briefly, for a given gRNA intended to target a N(20)NGG sequence in a species, we search for all potential off-target sites in the genome of that species that have ≤3 mismatches with the target sequence. For each potential off-target site identified this way, a single off-target score is calculated. Scores for all the off-target sites are then used in aggregate to calculate the final specificity score of the gRNA, which is between 0 and 100, with higher values indicating greater targeting specificity.

Please note that specificity scores are only a rough guide. Actual targeting efficiency and specificity could depart from what the scores predict. gRNAs with low scores may still work well.