Barcode Library 제작

VectorBuilder는 최첨단 바코드 라이브러리 서비스를 통해 연구자가 실험 중에 단일 세포 또는 단일 분자 수준에서 다중 분석을 실행할 수 있도록 지원합니다. 바코드 라이브러리는 E. coli 스톡, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스 형태로 제공 가능합니다. NGS 검증을 통해 균일하고 편향 없는 바코드 표현을 보장합니다.

중점 사항

  • 높은 복잡성:복잡성이 10 개를 초과하는 바코드 라이브러리를 생성할 수 있습니다.
  • 높은 균일성과 편향 없는 뉴클레오티드 분포
  • 완벽한 기술 지원:경험이 풍부한 당사의 과학자들이 바코드 라이브러리 디자인을 최적화하고 바코드 생성 및 라이브러리 클로닝을 위한 최적의 접근 방식을 선택하도록 도와드립니다.

서비스 세부 사항

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가격 및 소요시간   Price Match

Table 1.서비스 항목별 가격 및 소요시간

Service Module Brief Description Price (USD) Turnaround
Library 디자인 바코드 서열, 벡터 백본, 바코드 합성 전략 및 라이브러리 클로닝 전략의 설계를 포함하여 10 8보다 큰 복잡성을 달성하여 유전적 및 기능적 연구에서 강력하고 처리량이 높은 실험 적용을 가능하게 합니다. Free 1-4 days
Pooled library 클로닝 바코드 합성, 원하는 벡터 백본으로의 바코드 대량 병렬 클로닝, Sanger 시퀀싱에 의한 예비 검증, NGS에 의한 전체 검증이 포함됩니다. 제공물에는 E. coli 스톡의 라이브러리와 NGS 보고서가 포함됩니다. 자세한 내용은 아래 Table 2를 참조하세요.. 
Pooled library의 바이러스 패키징 바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 정보를 보려면  여기를 클릭하십시오. 라이브러리 플라스미드 패키징 가격은 단일 벡터 플라스미드 패키징 가격의 1.5배입니다.
스크리닝 후 샘플의 NGS deconvolution 스크리닝 된 세포의 게놈 DNA에서 NGS 라이브러리 준비, Illumina 시퀀싱(>500x 적용 범위) 및 데이터 분석이 포함됩니다. From $320 per sample 3-5 weeks

Table 2.Library 복잡성에 따른 library 클로닝 가격.

Library Complexity Price (USD) Turnaround
<10 6 From $2,800 5-8 weeks
10 6~ 10 7 From $4,000 5-8 weeks
10 7~ 10 8 From $6,500 8-11 weeks
>10 8 Please inquire

기술적인 정보

바코드 길이 및 복잡성

뉴클레오티드로 바코드를 생성하려면 다양한 정보를 나타내기 위해 DNA 염기의 고유한 서열을 할당해야 합니다. 우선, 짧은 뉴클레오티드 서열은 특정 세포에 대한 식별자와 같은 기본 정보를 암호화할 수 있습니다. 예를 들어, "ATCG"는 셀 1을 나타내고 "TAGC"는 셀 2를 나타낼 수 있습니다. 바코드 길이가 늘어남에 따라 인코딩된 정보의 복잡성과 다양성이 기하급수적으로 확장됩니다. 바코드가 길수록 더 많은 고유한 순열을 사용할 수 있으므로 더 많은 변형을 고유하게 식별할 수 있는 능력이 향상됩니다.

바코드 라이브러리의 최대 복잡성은 주어진 뉴클레오티드 세트로 생성할 수 있는 가능한 조합 수를 기반으로 계산할 수 있습니다. 무작위 뉴클레오티드로 구성된 바코드의 경우 각 위치에 A, T, G 또는 C의 4가지 결과가 있을 수 있습니다. 주어진 바코드 길이(N)에 대해 가능한 조합(복잡성)의 총 수는 4 입니다. 예를 들어 무작위 NNN 바코드에는 64(43)개의 가능한 조합이 있습니다. 

바코드 벡터 디자인

벡터에 바코드 배치하려면 효과적인 판독과 라이브러리 복제, 스크리닝 및 deconvolution 프로세스와의 호환성 보장을 위해 전략적으로 사항들을 고려해야 합니다. 렌티바이러스 벡터의 경우 바코드는 바이러스 벡터의 통합 영역 내에 통합되어 gRNA 또는 가변 영역과 같은 관련 유전 요소와 함께 숙주 게놈에 안정적으로 통합되어야 합니다. 전사된 영역 내에 바코드를 배치하면 RNA 전사체로 바코드 판독이 가능해집니다. 후속 분석을 용이하게 하려면 선택한 바코드 시퀀스가 ​​PCR 증폭 기술과 호환되어야 하며 바코드 영역을 효율적이고 균일하게 증폭할 수 있어야 합니다. 또한 바코드 디자인은 NGS 프로토콜과 일치해야 시퀀싱 프로세스 중에 감지 가능성과 정확한 정량화가 보장됩니다. 이상적으로 바코드 시퀀스는 아티팩트를 방지하기 위해 연구된 생물학적 과정을 간섭해서는 안 되지만, 이를 위해서는 많은 사전 지식이 필요한 경우가 많습니다.

연구자들은 바코드와 가변 영역에 대해 일대일 관계 또는 다중 대일 관계 중에서 결정해야 합니다. 일대일 관계에서 단일 바코드는 가변 영역을 고유하게 나타내므로 바코드와 해당 가변 영역 간의 간단하고 직접적인 연관이 보장됩니다. 반면, 다대일 관계에서는 여러 바코드가 동일한 가변 영역을 나타낼 수 있습니다. 이 접근 방식은 귀중한 이점을 제공합니다. 첫째, 생물학적 복제와 동일한 가변 영역에 해당하는 이러한 여러 바코드를 처리하면 적중 식별 중에 통계적 성능이 향상됩니다. 이렇게 증가된 통계적 힘은 진정한 긍정적인 히트를 식별하고 높은 처리량 실험에서 무작위 변동성과 구별하는 데 특히 유용합니다. 둘째, 동일한 가변 영역에 대해 여러 바코드를 활용하면 클론 분석이 가능하며, 이는 종양 세포와 같은 이종 세포 집단 연구에 특히 유용합니다.

B바코드 전달 및 NGS 판독

세포에 DNA 바코드를 전달하기 위해 연구자들은  lentivirus, AAV, retrovirus와 같은 바이러스 벡터와  piggyBac 및  Sleeping Beauty와 같은 트랜스포존 시스템을 사용할 수 있습니다. 벡터의 선택은 표적 세포 유형, 전달 효율 및 원하는 바코드 발현 기간과 같은 요인에 따라 달라집니다. NGS 분석을 위해 세포 바코드를 분리할 때 판독을 위해 RNA 또는 게놈 DNA를 사용할지 선택하는 것은 바코드를 세포에 도입하는 데 사용되는 전달 시스템에 따라 달라집니다. 바코드를 세포 게놈 DNA에 영구적으로 통합하는 시스템은 게놈 DNA 분리에 도움이 됩니다. 그러나 바코드를 신중하게 디자인하여 PCR 증폭에 적합하고 NGS 시퀀싱 프로토콜과 호환되도록 하는 것이 중요합니다. 반면, 바코드가 전사본의 일부로 표현되는 경우 RNA는 바코드 판독 역할을 할 수 있습니다. 전사체와 바코드 정보가 동시에 캡처되는 Perturb-Seq 및 CROP-Seq와 같은 단일 세포 RNA 시퀀싱 실험에서 RNA 판독은 실험 설계와의 호환성을 위해 필수적입니다. 

실험 데이타
barcode

Figure 1.각 위치의 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 및 티민(T)의 백분율을 보여주는 degenerate 뉴클레오티드 전략을 사용한 N (21)바코드의 뉴클레오티드 분포입니다. 그래프는 모든 위치에서 뉴클레오티드의 균일한 분포를 나타냅니다.

주문 방법

고객이 제공하는 library plasmid pool

고객이 제공하는 플라스미드 풀을 사용하는 경우  시료 제출 가이드라인에 따라 준비하여 보내주십시오. 시료의 손상이나 배송 지연을 방지하려면 배송 가이드라인을 따라 주시기 바랍니다. 고객이 제공하는 시료는 당사의 필수 QC를 거치며 각 항목에 대해 추가 $100의 요금이 부가될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료는 QC를 통과한 후 생산이 시작됩니다.  고객이 제공한 플라스미드 풀에 대해서는 라이브러리의 복잡성이나 균일성에 대해 보장하지 않습니다.

자료

FAQ
바코드 라이브러리를 설계할 때 고려해야 할 사항은 무엇입니까?

전달 시스템:표적 세포 및 실험 요구 사항을 기반으로 렌티바이러스, 레트로바이러스, AAV 또는 트랜스포존 시스템과 같은 적절한 전달 시스템을 선택합니다. 다른 시스템은 세포 게놈에서 바코드의 통합과 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다.

바코드 길이:최적의 바코드 길이를 결정하는 것이 중요합니다. 고려 사항에는 스크리닝 규모와 바코드 라이브러리의 이론적 최대 복잡성이 포함됩니다. 바코드가 길수록 복잡성이 높아지지만 합성 및 판독에 문제가 발생할 수 있습니다.

1-to-1 또는 multiple-to-1 상관관계:각 바코드가 단일 가변 영역에 해당하는지(1대1 상관관계) 또는 여러 바코드가 단일 가변 영역을 나타낼 수 있는지 결정합니다. 이 선택은 정보 캡처 시 특정 라이브러리의 해상도, 특이성 및 통계적 성능에 영향을 미칩니다.

바코드 시퀀스 디자인:미리 디자인된 시퀀스 또는 무작위 바코드 구조(고정 또는 무작위)가 포함될 수 있는 바코드 시퀀스 디자인 전략을 선택합니다. 디자인은 바코드 합성과 라이브러리 구축에 사용되는 전체 복제 전략에 영향을 미칩니다.

바코드 배치:원하는 판독 방법에 따라 게놈 또는 전사체 내 바코드 배치를 신중하게 고려합니다. 여기에는 게놈 DNA 또는 전사체 RNA 시퀀싱과 관련된 복제 전략과의 호환성 보장 및 다운스트림 판독 기술에 대한 설명이 포함됩니다.

바코드 실험의 일반적인 워크플로우는 무엇입니까?
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Figure 2.바코드 실험의 워크플로우 예시.

바이러스 벡터 전달을 사용하면 관심 있는 세포주를 바코드 라이브러리를 통해 낮은 MOI(다중 감염)로 변환하여 각 세포에 고유한 바코드를 표시할 수 있습니다. 바코드가 표시된 세포 집단은 클론 집단이 나타날 때까지 선택적 압력을 받습니다. 회수된 저항성 클론을 모아서 바코드 서열을 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하거나 NGS에 대한 바코드 정보를 암호화하는 전사체로부터 분리합니다. NGS 데이터는 모집단의 클론 수와 각 클론의 상대적 존재비에 대한 정량적 판독 값을 제공합니다.

주요 인용 논문

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