IVT mRNA 및 LNP-mRNA
VectorBuilder는 in vitro 및 in vivo에서 완전히 검증되고 바로 사용 가능한 IVT mRNA 및 LNP encapsulated IVT mRNA를 제공하며, 이는 mRNA 실험의 컨트롤로 사용하거나 LNP 기반 mRNA 전달 시스템의 효율성을 평가하는데 사용할 수 있습니다. 고객맞춤형 IVT mRNA 및 LNP preparation은 VectorBuilder의 mRNA Gene Delivery Solutions을 참조하시고, mRNA drug의 대량 생산은 CDMO 서비스를 참조하시기 바랍니다.
중점 사항
- 검증된 UTRs 및 N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)와 같은 modified nucleotides가 포함된 Cap1 mRNA
- 강력한 발현을 위해 서열 최적화된 HiExpressTM IVT mRNA
- Identity, purity 및 functionality을 보장하기 위한 포괄적이고 엄격한 품질 관리
제품 정보
IVT mRNA
Reporter gene mRNA
- EGFP IVT mRNA HOT
- Zebrafish EGFP IVT mRNA NEW
- mCherry IVT mRNA
- HiExpress™ Firefly Luciferase IVT mRNA HOT
- HiExpress™ Gaussia Luciferase IVT mRNA
LNP-mRNA
Reporter gene LNP-mRNA
배송 및 보관
mRNA 제품은 1 mM sodium citrate buffer (pH 6.4)에 저장되며, -80°C에서 12개월간 보관할 수 있습니다. LNP-IVT mRNA 제품은 Tris buffer (pH 7.4)에 저장되며, -80°C에서 6개월간 보관할 수 있습니다. 두 제품은 드라이아이스로 배송되며, 반복적인 동결-해동은 피하시기 바랍니다.
기술적인 정보
mRNA 및 LNP 생산의 일반적인 워크플로우
Figure 1. In vitro transcription에 의한 RNA 합성의 일반적인 워크플로우.
VectorBuilder의 mRNA 생산 워크플로우는 선호하는 코돈, GC 함량 및 RNA 2차 구조의 열역학적 안정성을 고려하여 템플릿 DNA 서열을 디자인하고 합성한 다음, in vitro transcription 벡터에 클로닝하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 plasmid DNA는 원하는 전사체를 생성하는 in vitro transcription 전에 정제, 검증 및 선형화됩니다. 변형된 뉴클레오티드는 in vivo 번역을 개선하고 면역원성을 감소시키기 위해 in vitro transcription 반응에 통합될 수 있습니다. 고효율 캡핑 (>95%)은 co-transcription 또는 효소 접근법을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그런 다음 mRNA는 mRNA-capture beads에 의한 기본 정제 프로세스 또는 별도 요청시 oligo dT 크로마토그래피로 정제됩니다. 다음으로, mRNA는 microfluidic mixer에서 LNP로 추가로 encapsulation될 수 있습니다. LNP 품질 관리를 위해 encapsulation 효율 및 나노입자 프로파일링을 분석합니다.
IVT mRNA에 대한 대표적인 품질관리 (QC) 결과
Figure 2. IVT mRNA의 대표적인 QC 결과.
(A) Denaturing agarose gel에서 샘플을 전기영동하여 IVT mRNA integrity를 평가했습니다. 예상 크기의 뚜렷한 밴드가 관찰되었습니다. (B) Biotinylated 5’ RNase H로 처리한 후 affinity로 농축하고, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)로 IVT mRNA capping efficiency를 분석했습니다. Cap 관련 절단된 것은 구별되는 질량 값으로 확인되었습니다. Deconvoluted 질량 스펙트럼에서 질량 피크 아래의 면적을 사용하여 cap 1 구조의 백분율을 계산하였습니다.
LNP-mRNA에 대한 대표적인 품질관리 (QC) 결과
LNP-mRNA에 대한 VectorBuilder의 QC 테스트에는 적격한 안전성, 안정성 및 효능을 보장하기 위한 다양한 매개변수 측정이 포함됩니다. 바로 사용할 수 있는 LNP-mRNA 제품에 대한 기본 QC 테스트에는 particle size, polydispersity index (PDI), zeta potential 및 encapsulation efficiency (EE%)가 포함됩니다.
VectorBuilder는 매우 낮은 PDI (최소 PDI<0.1)를 달성하기 위해 encapsulation 기술을 최적화했으며, 추가적으로 VectorBuilder는 모든 LNP-mRNA에 대해 -10mV에서 +10mV 사이의 zeta potential을 보장하여 제품의 균질성과 효능을 보장합니다.
Figure 3. LNP-mRNA의 대표적인 QC 결과.
(A) 입자 크기는 입자의 움직임으로 인해 변동하는 빛의 강도 차이를 측정하는 dynamic light scattering (DLS)에 의해 결정되었습니다. Polydispersity index (PDI)는 입자 크기에 대한 샘플의 이질성을 반영합니다. (B) Zeta potential은 LNP의 안정성을 반영합니다. 제타 전위는 -1.872 mV에서 +1.872 mV 사이입니다.
문서 자료
물질안전보건자료 (MSDS) 시험 성적서 (COA) 사용 설명서- IVT mRNA for in vitro applications
- LNP-mRNA for in vitro applications
- LNP-mRNA for in vivo applications
자주 묻는 질문
Cap 0는 5’ to 5’ triphosphate linkage를 통해 진핵생물 mRNA의 5' 말단에 추가되는 N7-methylguanosine (m7G)을 나타냅니다. 이 변형은 co-transcription으로 발생하는 일련의 효소 반응을 통해 추가되고, nuclear export, 전사체 안정성을 조절하는 기능을 하고, eukaryotic translation initiation factor (eIF4E)에 의한 인식을 통해 mRNA의 translation을 촉진하는 기능을 합니다. Cap 1은 m7G cap 외에 전사된 mRNA 서열의 첫번째 뉴클레오타이드 (m7GpppNm)의 2'O에 메틸기가 추가된 것 입니다. 포유류 세포에서 cap 1 구조는 mRNA가 선천성 면역에 의해 표적화되지 않고 자가로 인식되는 중요한 마커이다. 합성된 mRNA에 cap 1 구조를 추가하면 in vivo에서 mRNA 발현이 향상되고 면역원성이 감소하는 것으로 입증되었습니다.
In vitro transcription된 RNA에 대한 capping은 cap analogs와 함께 co-transcription되거나 또는 효소 반응을 통해 transcription 후에 발생할 수 있습니다. Capping 방법의 효율성은 LC-MS를 사용하여 검증하고 있습니다.
세포는 외부 RNA를 인식하면 면역 반응을 활성화하는 cytosolic 및 endosomal RNA receptors를 갖고 있습니다. 변형된 뉴클레오타이드는 일반적으로 endogenous cellular RNA에서 발견됩니다. mRNA에 특정 변형 뉴클레오티드를 포함하면 면역원성이 감소하고 2차 구조가 변경되며 서열 의존적 방식으로 translation 효율과 반감기가 증가합니다.VectorBuilder는 일반적으로 사용되는 N1-Methylpseudouridine(m1Ψ) 을 제공합니다. N1-Methylpsuedouridine tRNA에서 처음 확인된 자연 발생 뉴클레오타이드이지만, mRNA를 코딩하는데 사용하는 것을 최근에야 알게 되었습니다. Uridine의 이러한 메틸화된 유도체는 전통적인 Watson-Crick base pairing을 변경하지 않고 mRNA IVT 및 translation에서 표준 뉴클레오타이드를 대체할 수 있습니다. mRNA 치료제에 사용하는 주요 장점은 RNA immune receptors에 의한 인식을 변경하여 원치 않는 면역 효과를 완화하고 전사체 안정성 및 translation을 향상시키는 능력입니다.