혼합 shRNA (Pooled shRNA) Library

VectorBuilder는 인간 및 마우스의 유전자에 대한 고품질의 premade pooled shRNA library를 제공합니다. 이러한 RNAi library는 질병의 경로, 약물 치료에 대한 세포 반응, 발생 과정, 유전자 조절 등에 관련된 유전자들을 위한 대규모의 loss-of-function screening을 수행할 수 있는 강력하고 비용면에서 효율이 높은 도구입니다. 또한 고객이 원하는 유전자 리스트를 기반으로 맞춤형 pooled shRNA library를 설계 및 제작할 수 있습니다. 

제공되는 pooled shRNA library의 유형
  • 인간 유전자에 대한 2가지 규모의 ready-to-use, pooled, 렌티바이러스 library: Elite Gene (~2,000 PubMed Central에서 가장 많이 인용되는 유전자들) 및 Whole Genome (~19,000 RefSeq 유전자들)
  • 마우스 유전자에 대한 2가지 규모의 ready-to-use, pooled, 렌티바이러스 library: Elite Gene (~2,000 PubMed Central에서 가장 많이 인용되는 유전자들) 및 Whole Genome (~19,000 RefSeq 유전자들)
  • 맞춤형 pooled shRNA library (E.coli stock, DNA 또는 재조합 바이러스)

주문에 관련된 정보

가격 및 소요 시간
Product Name No. of genes No. of shRNAs Scale Catalog No. Price (USD) Turnaround
Human Elite Gene Pooled shRNA Library 2,161 12,471

Medium

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1037bjk) $1,499 10-20 days
Mouse Elite Gene Pooled shRNA Library 2,233 12,472

Medium

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1039sgb) $1,499
Human Whole Genome Pooled shRNA Library 18,432 92,917

Medium

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1038ngq) $1,499

Plus

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1038ngq) $4,499
Mouse Whole Genome Pooled shRNA Library 19,790 92,917

Medium

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1042tfx) $1,499

Plus

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1042tfx) $4,499

당사의 premade shRNA library가 고객의 수요를 만족시키지 못하는 경우, 당사의 custom library 제작 서비스를 보시기 바랍니다.

Deconvolution 서비스
shRNA library screening을 수행한 후 NGS에 의한 shRNA hits을 확인하는 방법에 대한 확신이 없으신가요? 고객의 genomic DNA를 VectorBuilder로 보내주시면 NGS library를 만들고 high-throughput sequencing을 수행한 후, 데이터를 분석하여 수 주 이내에 각 샘플의 정확한 shRNA 카운트를 제공해드립니다.
Deconvolution 서비스를 원하시는 경우 디자인 의뢰하기로 문의사항을 보내주시기 바랍니다. 

기술적인 정보

제품의 특징 View more

Genome-wide 타겟팅 및 높은 복합도

인간과 마우스에 대해 두가지 규모의 shRNA library를 제공합니다: Whole Genome (~19,000 RefSeq 유전자들) 및 Elite Gene (~2,000 PubMed Central에서 가장 많이 인용되는 유전자들). 평균적으로 모든 유전자는 RNAi consortium (TRC)의 가이드라인에 따라 일련의 규칙을 기반으로 계산된 우수한 knockdown scores를 가진 5-6개의 서로 다른 shRNA에 의해 타겟팅됩니다. 이를 통해 보다 안정적인 knockdown 및 보다 효과적인 screening이 가능합니다. 자세한 타겟 유전자 및 shRNA의 상세한 리스트는 “Technical documents”에서 확인할 수 있습니다.

높은 균일성

Pooled plasmid library는 next-generation sequencing (NGS)에 의해 검증되었으며, 이로부터 Elite Gene library에서는 100%의 shRNA를, Whole Genome library에서는 > 97%의 shRNA를 성공적으로 검출할 수 있었습니다. 또한 이들 plasmid library에서 shRNA representation은  매우 균일함을 볼 수 있었습니다 (Figure 1).

Figure 1.  Pooled plasmid library의 shRNA representation. shRNA read count를 NGS library size (10 million reads) 로 normalization한 후 log2 scale로 나타냈습니다.

잘 정립된 렌티바이러스 벡터와 바로 사용할 수 있는 높은 titer의 렌티바이러스

Pooled plasmid library는 인간 U6 promoter에 의해 3세대 렌티바이러스 벡터 시스템에서 발현되며, 이는 다양한 세포에서 타겟 유전자의 발현을 안정적으로 knockdown할 수 있는 고효율 시스템입니다. 이 렌티바이러스 벡터 시스템은 shRNA를 세포에 영구적이고 효율적이며 균일하게 도입할 수 있기 때문에 in vitro 유전자 screening에 이상적입니다. 모든 pooled shRNA library는 높은 functional titer (>10^8 TU/ml)의 바로 사용 가능한 렌티바이러스로 제공되어 고객이 바이러스 패키징 및 titer를 측정하는데 소요되는 시간을 절약해드립니다. 3세대 렌티바이러스 벡터 시스템은 자가복제 능력이 무력화되어 향상된 생물학적 안전성을 가지도록 최적화되었습니다.

Figure 2. 포유류 shRNA knockdown 렌티바이러스 벡터의 map.

shRNA library 벡터의 상세한 map과 서열을 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

렌티바이러스 shRNA knockdown 벡터에 대한 더 많은 정보를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

효율적이며 다양한 선별 또는 transduction된 세포의 추적을 위한 이중 marker

EGFP 및 puromycin 내성 유전자 (Puro)의 이중 marker 발현 카세트가 렌티바이러스 벡터에서 발현되어 puromycin에 의하여 transduction된 세포를 선별하고 녹색 형광에 의하여 시각적인 추적을 가능하게 합니다.

Figure 3. 인간 Elite Gene Pooled shRNA Library (MOI=10)로 transduction한 293T 세포들을 puromycin (1.5 ug/ml)으로 4일간 선별한 후의 EGFP 발현. 배율: 200x. 왼쪽: bright field. 오른쪽: EGFP.

Pooled shRNA library를 사용하는 genetic screening 워크플로우 View more

Pooled shRNA 렌티바이러스 library를 이용하는 genetic screening의 일반적인 워크플로우는 아래 Figure 4에서와 같습니다. 먼저 세포들을 shRNA 렌티바이러스 library로 transduction하고 transduction된 세포를 렌티바이러스 유전체에 존재하는 marker 유전자 (항생제 내성 또는 형광 marker) 의 발현에 의하여 선별합니다. 그 다음에, transduction된 세포를 기준 집단과 실험 집단으로 분할하고, 실험 집단에 특정한 selective pressure (약물 처리 또는 반복 계대 배양 등)를 적용하여 관심있는 표현형을 나타내는 세포를 확인합니다. Screening 전략에는 세가지 주요 유형이 있습니다. 1) selective pressure에 노출되었을 때 생존하는 세포에서 강화되거나 (enriched) 고갈되는 (depleted) shRNA를 검색하는 viability screening; 2) 세포 내에서 높거나 낮은 reporter의 발현 수준에 따라 강화되는 shRNA를 검색하는 reporter screening (예를 들어 reporter 유전자 발현을 조절하는 전사 인자를 타겟팅하는 shRNA); 3) 일반적으로 cell invasion, migration 등과 관련된 유전자에 영향을 미치는 shRNA를 확인하는 behavior screening. Screening 후 실험 및 기준 세포들로부터 Sanger sequencing 또는 NGS에 의하여, 기준 그룹과 비교하여 실험 그룹에서 강화되거나 고갈된 shRNA를 확인합니다. 강화되거나 고갈된 shRNA에 연관된 잠재적인 타겟 후보 유전자들은 downstream functional study에 의한 추가 연구로 확인할 수 있습니다.

Figure 4. Pooled shRNA 렌티바이러스 library를 이용한 loss-of-function screening의 워크플로우. [Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012)에서 인용함]

자주 묻는 질문

Array 기반의 RNAi screening과 비교할 때 pooled RNAi screening의 장점은 무엇입니까?

Pooled RNAi screening은 array 기반의 RNAi screening에 비하여 아래 표에서와 같은 많은 장점들이 있습니다:

Array 기반의 screening Pooled RNAi screening
shRNA 들을 원하는 세포에 어떻게 도입합니까? 각각의 shRNA를 multi-well plates (96-well 또는 384-well) 의 별개의 well에 처리해야 합니다. 수백 또는 수천의 다른 shRNA들을 세포 집단에 동시에 처리합니다.
관심 있는 표현형과 연관된 shRNA 들을 어떻게 확인합니까? 특정한 표현형을 나타내는 세포들을 선별하기 위하여 모든 well들을 확인하여야 합니다. 각각의 well에 처리된 shRNA들에 대한 정보는 이미 알려져 있습니다. 관심 있는 포현형을 나타내는 세포들이 집단적으로 선별됩니다. 강화되거나 고갈된 shRNA들을 sequencing에 의하여 확인합니다.
유전적인 상호작용을 발견할 수 있습니까? (각각의 well에 하나의 shRNA를 처리하는 경우와 같이) 불가능하거나, (각각의 well에 하나 이상의 shRNA를 처리하는 경우와 같이) 제한적입니다. 가능합니다 (세포들이 임의적으로 여러 가지의 다른 shRNA를 가질 수 있습니다).
기술적인 편차 (technical variation)
큽니다. 작습니다.
인력 및 시약 소요 비용 높습니다. 낮습니다.
특수한 장비에 대한 요구도 높습니다 (예를 들어, liquid handler, high-throughput imaging, 등). 낮습니다 (기존의 benchtop 장비로 가능함).
shRNA knockdown score는 어떻게 계산됩니까?

VectorBuilder에서는 RNAi consortium (TRC) 에서 이용하는 것과 유사한 규칙에 따라서 shRNA의 디자인과 score 계산을 합니다. 하나의 RefSeq transcript에 대하여 candidate target site로 이용될 수 있는 모든 가능한 21mer들을 검색합니다. Candidate들 중에서 knockdown 효율과 특이성 (specificity)을 감소시킬 것으로 생각되거나, 4개 이상의 같은 염기가 반복되거나, 7개 이상의 G 또는 C가 반복되거나, GC 함량이 25% 미만 또는 60%를 초과하거나, 5' end에 AA 서열이 있는 등 클로닝에 문제가 될 수 있는 서열들은 제외됩니다. Candidate가 서열 내부의 stem-loop 구조, 3' end 쪽의 높은 GC 함량, 알려진 miRNA seed 서열을 포함하거나, 다른 유전자에 off-target으로 match되는 경우에는 knockdown score에 불이익을 받게 되어 선택될 가능성이 낮아지게 됩니다. 여러 개의 transcript가 존재하는 유전자의 경우, 모든 transcript에 존재하는 서열이 더 높은 score를 받게 됩니다.

모든 score는 0 이상으로, 평균 5, 표준편차 5 정도의 분포를 나타내며, 95%의 score가 15 이하입니다. Knockdown score가 15 정도인 shRNA들은 최상의 knockdown performance와 클로닝 가능성을 가진 것으로 간주되며, knockdown score가 0 인 경우 최악의 knockdown performance를 가지거나 클로닝이 어려운 shRNA로 간주됩니다.

이러한 knockdown score는 대략적인 가이드에 불과하다는 점에 유의해주시기 바랍니다. 실제 knockdown 효율은 score로 예상되는 것과 큰 차이가 있을 수 있습니다. Score가 낮은 타겟 부위도 실제로는 knockdown을 잘 할 가능성이 있습니다. 타겟 유전자의 3’ UTR도 코딩 부위와 마찬가지로 효과가 있을 수 있습니다.