헤르페스단순포진바이러스 Herpes Simplex Virus (HSV)

HSV BAC 벡터

HSV BAC은 바이러스 증식을 허용하는 진핵 세포에서 homologous recombination을 통해 BAC backbone 서열을 HSV 유전체에 삽입하여 만들어집니다. EGFP와 같은 선별 마커는 BAC 서열을 성공적으로 결합한 재조합 바이러스를 정제하는데 도움이 됩니다. Herpesvirus 유전체는 숙주 세포 핵에서 복제되는 과정에서 원형화된 중간체를 형성하며, 이는 이후 E. coli에 형질전환하기 위해 분리됩니다. BAC backbone에 존재하는항생제 내성 유전자는 바이러스 BAC를 가진 박테리아 세포의 선별을 용이하게 합니다. 마지막 단계는 박테리아 세포에서 바이러스 BAC DNA를 분리하여, 제한효소 처리 및 시퀀싱 분석을 통해 온전함을 검증합니다. 일단 검증이 되면 HSV BAC은 바이러스 증식이 가능한 진핵 숙주세포에 transfection되어 살아있는 바이러스를 생성합니다.

HSV는 유전체의 크기가 크기 때문에, HSV를 클로닝하기 위해 일반 plasmid 벡터를 사용하는 것은 불가능합니다. 반면에 BAC은 큰 DNA 서열을 운반하는 능력과 느린 복제율로 인해 HSV 생물학 연구에 선호되는 벡터입니다. HSV BAC은 임상적으로 분리된 바이러스를 바이러스 증식을 허용하는 세포에서 증식하는 것과 비교할 때, E. coli 에서 BAC 으로 유지하는 것이 바이러스 서열이 더 안정하게 유지될 수 있도록 해줍니다. 또한 HSV BAC은 일반적인 유전공학 기술을 사용하여 바이러스 유전체를 매우 쉽고 정확하게 조작할 수 있기 때문에 원하는 변이 바이러스를 생성할 수 있는 유연성을 제공합니다.

HSV BAC은 위에서 언급한 여러 가지 장점을 제공하지만 고려해야 할 몇 가지 제한사항이 있습니다. HSV BAC은 바이러스 유전체 내에 존재하는 반복적인 서열의 불안정성으로 인해 원하지 않는 변이가 생겼는지 주기적으로 확인해야 합니다. 또한, 바이러스 유전체 내에 포함된 BAC backbone으로 인해 바이러스 유전체의 크기가 커지면서 바이러스의 증식을 방해할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 HSV BAC을 디자인할 때 BAC backbone 양쪽에 loxP 또는 FRT 사이트를 포함하여 각각 Cre 또는 Flp에 의한 재조합으로 BAC backbone을 제거할 수 있도록 하는 것이 바람직합니다.

HSV amplicon 벡터

Amplicon은 최소한의 바이러스 서열 외에 하나 이상의 관심유전자 (GOI) 를 포함하는 HSV-1 기반의 plasmid이며, HSV-1 helper 바이러스나 클로닝된 HSV-1 유전체가 helper로 존재할 때 살아있는 HSV 입자로 패키징될 수 있습니다. Amplicon은 바이러스에서 유래된 것으로는 두가지 서열만을 포함하며, 이들은 패키징 세포에서 바이러스 복제를 허용하는 oriS로 알려진 origin of replication과 살아있는 바이러스로의 패키징을 용이하게 하는 pac으로 알려진 패키징 서열들입니다. HSV 입자는 amplicon plasmid의 tandem repeat로 구성된 head-to-tail concatemer를 생성함으로써 야생형 HSV-1에서 사용되는 것과 유사한 rolling-circle 메커니즘에 의해 amplicon 유전체를 복제함으로써 생성됩니다.

Amplicon 벡터는 최대 150kb의 긴 서열을 운반할 수 있고, 쉽게 클로닝할 수 있으며, 다양한 세포 유형을 transduction할 수 있는 능력 및 높은 transduction 효율 등의 유전자 전달 도구로서의 장점을 제공합니다. 또한, 바이러스 단백질을 인코딩하는 서열이 없기 때문에 transduction한 세포와 생물체에 대한 독성과 병원성이 전혀 없으며, 숙주 세포 내의 잠복하여 존재할 수 있는 바이러스 유전체와 작용하여 활성화시키거나 재조합할 가능성을 최소화할 수 있습니다.

오랫동안 amplicon 기반 유전자 전달의 주요 한계는 helper 바이러스가 없는 높은 titer의 amplicon 벡터 stock을 생성하는 것이었습니다. helper 바이러스로 오염된 amplicon stock은 잠재적인 세포 독성 및 염증 반응을 유발할 수 있으므로 유전자 치료에 적합하지 않습니다. Helper의 기능을 제공하기 위해 바이러스 패키징 시그널만을 제외한 전체 HSV-1 게놈을 포함하는 중복된 cosmid 또는 BAC 벡터들을 활용하는 helper 바이러스가 없는 패키징 시스템을 개발함으로써 이 문제는 상당부분 극복이 되었습니다. 이 방법은 helper 바이러스가 거의 없는 amplicon stock을 생성할 수 있지만, 높은 바이러스 titer를 얻을 수 없다는 제약이 있습니다. Helper 바이러스의 오염을 최소화하면서 높은 titer의 amplicon stock을 얻기 위한 대안으로 Cre-lox 기술을 사용하여 바이러스를 생성하는 세포에서 helper 바이러스의 패키징 시그널을 제거하는 방법이 있습니다. 그러나 이 방법을 사용하여 생산된 amplicon stock은 여전히 ​​매우 낮은 수준의 helper 바이러스로 오염될 수 있으므로 특정 유전자 치료 응용분야에서는 사용이 제한될 수 있습니다.

Replication (복제) 이 결손된 HSV 벡터 

복제가 결손된 HSV 벡터는 바이러스 복제에 필수적인 유전자의 결실 또는 변이에 의해 생성됩니다. 복제 결함 HSV는 복제에 필요한 바이러스 단백질이 이를 발현하는 세포주에 의하여 제공될 때만 증식을 할 수 있습니다. 지금까지 보고된 대부분의 복제 결함 HSV 벡터는 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47을 포함한 infected cell protein (ICP)을 인코딩하는 immediate-early (IE) 유전자를 다양한 조합으로 제거함으로써 생성되었습니다. ICP는 각각 바이러스 유전체 복제 및 virion 구조의 조립에 필수적인 단백질들을 인코딩하는 일련의 early (E) 및 late (L) 바이러스 유전자의 전사를 시작하기 위해 HSV가 숙주 세포에 들어간 직후 발현됩니다. 따라서 IE 유전자의 결실은 초기 및 후기 바이러스 유전자들의 발현을 억제합니다.

복제 결함 HSV 벡터의 최신 버전은 복수의 IE 유전자의 결실에 의해 생성되었으며, 이 벡터는 더 적은 수의 IE 유전자의 결실에 의해 생성된 이전 버전에 비해 세포에 대한 독성이 훨씬 더 작습니다. 이러한 벡터에서 일부 비필수 유전자와 함께 여러 필수 유전자의 제거는 벡터의 유전자 운반능력을 증가시켜 여러 개의 독립적인 유전자 발현 카세트를 발현하는데 사용할 수 있는 이점을 제공합니다. 따라서 이러한 벡터는 여러 개의 transgene을 동시에 발현할 필요가 있는 유전자 치료 분야에 매우 적합합니다.

복제 결함 HSV 벡터의 주요한 단점은 단일 IE 유전자의 결실에 의해 생성된 벡터들에서 관찰되는 세포에 대한 독성입니다. 5개의 IE 유전자 모두를 제거한 벡터는 세포에 대한 독성 문제를 상당히 줄일 수 있지만, 이러한 벡터는 세포 배양에서 증식이 잘 안되고 transgene 발현 수준이 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서 복제 결함 HSV 벡터의 최적 성능을 위해서는 올바른 조합으로 필수적인 유전자들을 제거하는 일이 매우 중요합니다. 복제 결함 HSV 벡터의 다른 단점은 이러한 벡터의 증식이 결여된 바이러스 단백질을 공급할 수 있는 세포주에 대한 큰 의존성을 갖는다는 점입니다.

Attenuated (독성이 약화된) HSV 벡터

Attenuated HSV 벡터 (conditional replicating HSV 벡터라고도 함)는 in vivo에서 바이러스-숙주 상호 작용의 다양한 측면에 관여하는 유전자들처럼 in vitro에서 바이러스 복제에 필수적이지 않은 유전자의 결실 또는 변이에 의해 생성됩니다. 따라서 attenuated HSV는 세포 배양에서는 복제할 수 있지만, in vivo의 특정 조건에서는 복제할 수 없습니다. 이와 같은 특성을 이용하여 정상 세포에서는 복제할 수 없지만 종양 세포에서는 선택적으로 복제할 수 있는 여러 attenuated HSV 벡터가 종양용해제로 개발되고 있습니다.

복제가 안되는 HSV 벡터에 비하여 attenuated HSV 벡터는 복제하고 감염을 쉽게 확산할 수 있는 능력으로 인해 훨씬 더 효율적으로 유전자 전달을 할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한 attenuated HSV 벡터를 바이러스 백신으로 사용하면 숙주의 면역 체계가 모든 바이러스 항원에 노출될 수 있는 기회를 제공하여, 세포성 면역 및 체액성 면역을 모두 자극할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 벡터는 상대적으로 쉽게 세포 배양에서 증식할 수 있으므로 백신 개발을 위한 비용적인 효율성을 제공합니다.

Attenuated HSV 벡터의 주요한 제한은 복제 능력으로 인해 발생할 수 있는 여러 가지 잠재적인 안전 문제입니다. Attenuated HSV 벡터와 관련된 위험에는 복제하는 바이러스가 in vivo에서 변이나 재조합에 의하여 더 큰 병원성을 갖는 바이러스로 변이될 가능성, 바이러스 또는 변이 바이러스가 환자로부터 다른 사람에게로 퍼질 가능성, 바이러스 또는 변이 바이러스가 환자 또는 태아에게 병원성을 나타내게 될 가능성 등이 있습니다. Attenuated 벡터의 또 다른 단점은 바이러스를 과도하게 약화시켜 그 효과를 크게 감소시킬 수 있다는 점입니다. 따라서 원하는 기능을 가진 attenuated 벡터를 만들기 위해서는 제거되거나 변이될 유전자들을 신중하게 선택하는 것이 매우 중요합니다.

종양용해제로서의 HSV 벡터

여러 가지 요인으로 인해 HSV-1 벡터가 종양용해 바이러스 치료법을 위한 매력적인 후보가 되게 합니다. HSV-1은 감염성이 매우 높아 10시간 만에 전체 복제주기를 완료하여 수천 개의 progeny virion을 방출하는데, 이는 adenovirus와 같은 다른 일반적인 바이러스에 비해 훨씬 더 빠릅니다. HSV-1 virions은 세포외 확산 이외에도 세포들 사이의 junction을 통해 한 세포에서 다른 세포로 확산될 수 있어 고형 종양 내에서 매우 효율적인 바이러스 확산이 가능합니다. 또한 HSV-1은 다양한 실험실 동물들을 효과적으로 감염시키는 것으로 밝혀져 in vivo 전임상 연구에 매우 적합합니다.

암세포에서 선택적으로 복제하고 암세포를 죽이도록 디자인된 attenuated HSV 벡터는 종양용해 바이러스로 널리 사용되고 있습니다. 이러한 벡터는 정상 세포에서 바이러스 복제에 필수적이지만 종양 세포에는 필수적이지 않은 유전자를 제거하여 생성할 수 있습니다. 이러한 벡터의 항종양 효과는 항종양이거나 화학치료제를 활성화할 수 있는 유전자를 전달하도록 변형함으로써 더욱 향상될 수 있습니다. 현재 흑색종 치료에 사용되는 FDA 승인 약물인 Talimogene Laherparepvec (TVEC)는 종양용해 잠재력이 있는 attenuated HSV-1 벡터의 예입니다. TVEC는 각각 정상 세포에서 바이러스 복제를 억제하고 면역 체계를 활성화시키는 바이러스 유전자 ICP34.5 및 ICP47을 제거하여 HSV-1에서 파생되었습니다. TVEC의 종양용해 잠재력은, 수지상 세포 (dendritic cell) 의 이동 및 성숙을 촉진하여 면역 시스템을 더욱 자극하는human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)를 인코딩하는 유전자의 과발현에 의해 더욱 증가됩니다.

Attenuated 벡터 외에도 복제 결함 HSV 벡터도 다양한 암 치료에 널리 사용되어 왔습니다. 이러한 접근법은 주로 thymidine kinase (TK)와 같은 자살 유전자 또는 종양 세포 내에서 TNF-α와 같은 치료 잠재력을 가진 유전자를 단독으로 또는 조합하여 발현하는 복제 결함 HSV를 주로 활용하고 있습니다.

백신으로서의 HSV 벡터

HSV 벡터는 다음과 같은 바이러스 및 박테리아 병원체에 대한 바이러스 백신으로 사용될 수 있는 여러 가지 장점을 제공합니다. 1) 다양한 경로를 통한 접종에 대한 반응으로 숙주 생물에서 강력한 면역 반응을 유도하는 능력; 2) 숙주 세포의 유전체에 결합하지 않고, 숙주 세포 핵에서 episome으로 지속적으로 유지되는 능력; 3) ganciclovir와 같은 비독성 약물을 세포독성 대사산물로 전환하는 능력을 가져서 원치 않는 효과가 발생할 경우 바이러스에 감염된 세포를 죽이는데 사용될 수 있는 TK 유전자가 HSV 유전체에 자연적으로 존재한다는 점 등입니다. HSV-BAC, amplicon 벡터, 복제 결함 HSV 벡터 및 attenuated HSV를 사용한 연구는 모두 다양한 병원체에 대한 바이러스 백신으로 사용될 때 유망한 결과를 보여주었습니다.

Attenuated HSV 벡터는 숙주의 면역 시스템이 모든 바이러스 항원에 노출될 수 있는 기회를 제공하여 세포성 면역 및 체액성 면역을 모두 자극하기 때문에 anti-HSV 백신 개발에 특히 적합합니다. 또한, attenuated 생백신은 비활성 백신이나 바이러스 유전체의 특정한 일부 서열만 발현하는 백신 벡터에 비해 더 장기적이고 효과적인 방어를 제공하는 것으로 나타났습니다. 세계 인구의 상당한 부분이 HSV-1 및 HSV-2에 감염되어 있고, 현재 이들에 대한 FDA에서 승인된 백신이 없다는 점을 고려할 때, anti-HSV 백신 개발이 절박한 상황입니다. 바이러스 당단백질 gK 및 막단백질 UL20의 부분 결실에 의해 개발된 attenuated 생 HSV-1 벡터인 VC2는 HSV-1 및 HSV-2 감염에 대한 동물 모델에서 테스트했을 때 백신 후보로서 큰 잠재력을 보여주었습니다.

바이러스 복제에 필수적인 유전자가 제거되고 특정한 외래 항원을 발현하는 복제 결함 HSV 돌연변이는 바이러스 및 세포 내 박테리아 감염의 다양한 동물 모델에서 백신으로 투여될 때 지속적이고 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다. 또한, amplicon 벡터는 마우스 모델을 사용한 여러 전임상 연구에서 암, 미생물 감염 및 신경 질환에 대한 치료 백신으로 널리 이용되어 왔습니다. 그러나 기존에 HSV에 대한 면역이 있는 경우를 포함하는 다른 동물 모델에서 면역원성 잠재력을 평가하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

유전자 전달 운반체로서의 HSV 벡터

HSV amplicon벡터는 신경친화성, 큰 유전자 운반능력 (<150kb), 낮은 독성 및 표적 세포 내에서 episome으로 남아 있는 능력으로 인해 신경세포에 대한 유전자 전달 매개체로 특히 적합합니다. 따라서 다음과 같은 분야의 연구에 널리 사용되어 왔습니다: 1) 알츠하이머 및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환; 2) 우울증과 중독을 포함한 신경정신 질환; 및 3) 급성 허혈 뇌졸중과 같이 신경계에 치료 유전자를 전달해야 하는 질병의 치료. 또한 다양한 종류의 분열하는 세포를 감염시키는 능력과 plasmid transfection에 비해 상대적으로 쉬운 HSV amplicon 벡터를 사용한 세포 감염 등의 특성에 의해 amplicon 벡터는 in vitro 약리학 연구에 매우 적합합니다.

복제 결함 HSV 벡터는 바이러스 복제에 필수적인 유전자의 결실에 따른 현저히 감소된 세포독성 때문에 유전자 치료를 위한 유전자 전달 매개체로도 사용됩니다. 여러 유전자의 제거에 의하여 이러한 벡터는 큰 유전자 운반능력을 가지게 되어서, 다중 유전자 치료에 사용되는 벡터에 일반적으로 요구되는 여러 개의 독립된 유전자 발현 카세트들을 운반할 수 있습니다. 따라서 복제 결함 벡터는 만성 통증, 파킨슨 병, 척수 손상 및 lysosomal storage disorders 등을 위한 동물 모델에서 유전자 치료 연구에 널리 사용되어 왔습니다. Human preproenkephalin (PENK)을 발현하는 복제 결함 HSV 벡터인 NP2는 통증 치료를 위한 1상 임상 시험에서 유망한 결과를 보여주었습니다.