Mutation Library 제작

VectorBuilder는 맞춤형 돌연변이 유발 라이브러리 구축에 대한 광범위한 전문 지식을 제공합니다. 이러한 라이브러리는 단백질의 주요 잔기와 도메인을 조사하기 위한 초기 단계로서 많은 연구에서 중요합니다. 우리는 칩 기반 합성, error-prone PCR, 퇴화 코돈 활용 및 DNA 셔플링을 포함하여 돌연변이 풀을 생성하기 위한 다양한 전략을 제공합니다. 이러한 돌연변이는 단일 영역에 국한되거나 서열을 따라 여러 영역에 걸쳐 분포될 수 있습니다.

중점 사항

  • 다양한 클로닝 전략: 연구 목표에 맞춰 다양한 접근 방식을 사용하여 돌연변이 라이브러리를 구축합니다.
  • 높은 복잡성: 복잡성이 108을 초과하는 돌연변이 라이브러리를 생성할 수 있습니다.
  • 뛰어난 적용 범위 및 높은 균일성: 당사 라이브러리는 일반적으로 표적 변종에 대해 98% 이상의 적용 범위를 달성합니다.

서비스 세부사항

landing page workflow
가격 및 소요시간 Price Match
Service Module Brief Description Price (USD) Turnaround
Mutation library 디자인 고도로 숙련된 과학자들로 구성된 VectorBuilder 팀은 다양한 전략을 사용하여 맞춤형 돌연변이 라이브러리를 설계합니다. 검증된 벡터 백본의 광범위한 컬렉션 중에서 선택할 수 있는 옵션이 있습니다. Free 1-4 days
Pooled library 클로닝 올리고/유전자 합성, 가변 영역 삽입물을 원하는 벡터 백본으로 대량 병렬 클로닝, Sanger 시퀀싱을 통한 예비 검증, NGS를 통한 전체 검증이 포함됩니다. 제공물에는 E. coli 스톡의 라이브러리와 NGS 보고서가 포함됩니다. From $2,300 5-8 weeks
Pooled library의 바이러스 패키징 바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 정보를 보려면 여기를 클릭하십시오. 풀링된 라이브러리 패키징 가격은 단일 벡터 패키징 가격의 1.5배입니다.
스크리닝 후 샘플의 NGS deconvolution 스크리닝된 세포의 게놈 DNA에서 NGS 라이브러리 준비, Illumina 시퀀싱(>500x 적용 범위) 및 데이터 분석이 포함됩니다. From $320 per sample 3-5 weeks

기술적인 정보

Mutation library 제작 전략
Mutation library construction strategies

Chip-based oligo synthesis

칩 기반 올리고 합성은 특정 부위에 대한 포화 돌연변이와 같은 다양한 크기와 서열을 가진 사전 설계된 서열 변형을 생성하는 데 이상적입니다. 우리의 칩 기반 DNA 합성은 일반적으로 낮은 오류율로 최대 300nt 까지 올라갈 수 있습니다.

Error-prone PCR

오류가 발생하기 쉬운 PCR(Error-prone PCR)은 원래 서열에 돌연변이를 유발하기 위해 표준 PCR 방법을 변형한 것으로 가변적인 돌연변이 라이브러리를 생성하기 위한 가장 간단한 접근 방식입니다. 보다 구체적으로, 오류가 발생하기 쉬운 PCR은 원래 서열에 무작위 점 돌연변이를 도입하기 위해 낮은 fidelity의 중합효소, 더 긴 extension 시간, 더 높은 Mg2+ 농도, Mn2+ 추가 및 다양한 dNTP 농도를 포함한 다양한 PCR 조건의 조합을 사용합니다.

Degenerate codon

유전암호의 퇴화로 인해 하나의 아미노산이 여러 코돈에 의해 암호화될 수 있습니다. 올리고뉴클레오티드 합성에서 퇴화 코돈은 통제되고 높은 무작위 돌연변이를 도입합니다. 이 접근 방식을 사용하면 양성 적중(positive hit) 결과를 얻을 수 있는 영역과 아미노산에 집중할 수 있습니다. 예를 들어, 널리 사용되는 퇴화 돌연변이 라이브러리인 NNK 라이브러리에는 20개의 아미노산과 1개의 stop codon을 모두 코딩하는 32개의 코돈 조합(N= A/C/G/T, K= G/T)을 포함하는 NNK 퇴화 프라이머가 포함됩니다. 라이브러리 구성에 퇴화 코돈을 활용하는 것은 다양성을 도입하는 효과적인 방법입니다.

Degenerate Codon # Codons Stop Codon Amino Acids
NNN 64 3 All 20
NNK / NNS 32 1 All 20
NDT 12 0 RNDCGHILFSYV
DBK 18 0 ARCGILMFSTWV
NRT 8 0 RNDCGHSY

DNA shuffling

DNA 셔플링은 상동성 재조합을 통해 키메라 DNA 서열을 생성하는 매우 효율적인 방법입니다. 이 기술은 모체 유전자를 무작위 단편으로 분해한 후 프라이머 없는 PCR을 사용하여 새로운 변이체로 재조립하는 과정을 포함하며, 이는 재조합을 위한 부분 서열 상동성에 의존합니다. 또는 합성 셔플링을 사용하여 합리적인 설계와 방향성 진화를 결합하여 복잡성이 높은 라이브러리를 만들 수 있습니다. DNA 패밀리 셔플링은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 같은 다른 돌연변이 유발 방법에 따라 사용될 수도 있습니다.

실험 데이타
Nucleotide composition of (NNK)11 in the plasmid library

Figure 1. (NNK)11 플라스미드 라이브러리의 뉴클레오티드 구성. 라이브러리는 NNK 퇴화 코돈 전략을 사용하여 구축되었습니다. 각 막대는 DNA 서열을 따라 뚜렷한 뉴클레오티드 위치를 나타내며, 색상은 관찰된 뉴클레오티드를 나타냅니다. 모든 포지션이 이론적 수치(N = 25% A + 25% T + 25% G + 25% C, K = 50% T + 50% G)에 근접한 빈도의 예상 뉴클레오티드를 나타냈습니다.

Distribution of amino acids in a 7-mer variable region of a plasmid library

Figure 2. 플라스미드 라이브러리의 7-mer 가변 영역의 아미노산 분포. 라이브러리는 NNK 퇴화 코돈 전략을 사용하여 구축되었습니다. 각 막대는 특정 아미노산 또는 정지 코돈의 이론적(청록색) 또는 실제(분홍색) 비율을 나타냅니다. 모든 20개 아미노산과 정지 코돈의 관찰된 빈도는 이론적인 빈도와 거의 일치했습니다.

mutationComplexity, coverage, and alignment rate of chip-based oligo libraries constructed by VectorBuilder.

Figure 3. VectorBuilder로 구성된 칩 기반 올리고 라이브러리의 복잡성, 적용 범위 및 정렬 비율. (A) 라이브러리 복잡성 범위는 102 에서 105를 초과합니다. (B) 적용 범위와 읽기 정렬 비율이 모두 매우 높아 라이브러리의 탁월한 적용 범위와 낮은 오류율이 강조되었습니다.

주문 방법

고객이 제공하는 library plasmid pool

고객이 제공하는 플라스미드 풀을 사용하는 시료 제출 가이드라인에 따라 준비하여 보내주십시오. 시료의 손상이나 배송 지연을 방지하려면 배송 가이드라인을 따라 주시기 바랍니다. 고객이 제공하는 시료는 당사의 필수 QC를 거치며 각 항목에 대해 추가 $100의 요금이 부가될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료는 QC를 통과한 후 생산이 시작됩니다. 고객이 제공한 플라스미드 풀에 대해서는 라이브러리의 복잡성이나 균일성에 대해 보장하지 않습니다.

자료

FAQ
돌연변이 라이브러리에 대한 다양한 돌연변이 유발 전략의 장점과 한계는 무엇입니까?
Strategy Advantages Limitations
Error-prone PCR
  • 빠른 돌연변이 생성
  • 표적 서열에 대한 지식이 필요하지 않음
  • 효율적 비용
  • 다중 또는 의도하지 않은 돌연변이가 발생할 가능성이 높아 돌연변이를 정밀하게 제어하는 ​​데 어려움이 있을 수 있음
  • NGS를 통한 GOI 전체의 돌연변이 식별에 대한 어려움
Degenerate codon
  • 매우 다양한 변형 풀을 생성함
  • 특정 위치에 여러 가지 다른 아미노산을 통합 가능
  • 적절한 퇴화 코돈 선택으로 편향 방지
  • 정지코돈 생성 가능
  • 올리고 합성은 기술적으로 까다롭고 비용이 많이 듦
DNA shuffling
  • 기능성 돌연변이 생성 가능성 증가
  • 변종 다양성을 높이기 위해 다른 돌연변이 유발 접근법과 결합 가능
  • 전체 유전자 서열의 재조합 가능
  • 의도하지 않은 시퀀스 조합 도입 가능
  • 노동 집약적
  • NGS를 통한 전체 길이의 돌연변이 식별에 어려움 있음
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