Mutation Library 제작

기술적인 정보

Mutation library 제작 전략

Chip-based oligo synthesis

칩 기반 올리고 합성은 특정 부위에 대한 포화 돌연변이와 같은 다양한 크기와 서열을 가진 사전 설계된 서열 변형을 생성하는 데 이상적입니다. 우리의 칩 기반 DNA 합성은 일반적으로 낮은 오류율로 최대 300nt 까지 올라갈 수 있습니다.

Error-prone PCR

오류가 발생하기 쉬운 PCR(Error-prone PCR)은 원래 서열에 돌연변이를 유발하기 위해 표준 PCR 방법을 변형한 것으로 가변적인 돌연변이 라이브러리를 생성하기 위한 가장 간단한 접근 방식입니다. 보다 구체적으로, 오류가 발생하기 쉬운 PCR은 원래 서열에 무작위 점 돌연변이를 도입하기 위해 낮은 fidelity의 중합효소, 더 긴 extension 시간, 더 높은 Mg²⁺ 농도, Mn²⁺ 추가 및 다양한 dNTP 농도를 포함한 다양한 PCR 조건의 조합을 사용합니다.

Degenerate codon

유전암호의 퇴화로 인해 하나의 아미노산이 여러 코돈에 의해 암호화될 수 있습니다. 올리고뉴클레오티드 합성에서 퇴화 코돈은 통제되고 높은 무작위 돌연변이를 도입합니다. 이 접근 방식을 사용하면 양성 적중(positive hit) 결과를 얻을 수 있는 영역과 아미노산에 집중할 수 있습니다. 예를 들어, 널리 사용되는 퇴화 돌연변이 라이브러리인 NNK 라이브러리에는 20개의 아미노산과 1개의 stop codon을 모두 코딩하는 32개의 코돈 조합(N= A/C/G/T, K= G/T)을 포함하는 NNK 퇴화 프라이머가 포함됩니다. 라이브러리 구성에 퇴화 코돈을 활용하는 것은 다양성을 도입하는 효과적인 방법입니다.

DNA shuffling

DNA 셔플링은 상동성 재조합을 통해 키메라 DNA 서열을 생성하는 매우 효율적인 방법입니다. 이 기술은 모체 유전자를 무작위 단편으로 분해한 후 프라이머 없는 PCR을 사용하여 새로운 변이체로 재조립하는 과정을 포함하며, 이는 재조합을 위한 부분 서열 상동성에 의존합니다. 또는 합성 셔플링을 사용하여 합리적인 설계와 방향성 진화를 결합하여 복잡성이 높은 라이브러리를 만들 수 있습니다. DNA 패밀리 셔플링은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 같은 다른 돌연변이 유발 방법에 따라 사용될 수도 있습니다.

실험 데이타

Figure 1. (NNK)₁₁ 플라스미드 라이브러리의 뉴클레오티드 구성. 라이브러리는 NNK 퇴화 코돈 전략을 사용하여 구축되었습니다. 각 막대는 DNA 서열을 따라 뚜렷한 뉴클레오티드 위치를 나타내며, 색상은 관찰된 뉴클레오티드를 나타냅니다. 모든 포지션이 이론적 수치(N = 25% A + 25% T + 25% G + 25% C, K = 50% T + 50% G)에 근접한 빈도의 예상 뉴클레오티드를 나타냈습니다.

Figure 2. 플라스미드 라이브러리의 7-mer 가변 영역의 아미노산 분포. 라이브러리는 NNK 퇴화 코돈 전략을 사용하여 구축되었습니다. 각 막대는 특정 아미노산 또는 정지 코돈의 이론적(청록색) 또는 실제(분홍색) 비율을 나타냅니다. 모든 20개 아미노산과 정지 코돈의 관찰된 빈도는 이론적인 빈도와 거의 일치했습니다.

Figure 3. VectorBuilder로 구성된 칩 기반 올리고 라이브러리의 복잡성, 적용 범위 및 정렬 비율. (A) 라이브러리 복잡성 범위는 10² 에서 10⁵를 초과합니다. (B) 적용 범위와 읽기 정렬 비율이 모두 매우 높아 라이브러리의 탁월한 적용 범위와 낮은 오류율이 강조되었습니다.