벡터 클로닝 (Vector Cloning)

세계 최대의 맞춤형 벡터 클로닝 서비스 회사인 VectorBuilder는 연구 목적에 맞는 모든 맞춤형 DNA 벡터를 실제로 클로닝할 수 있습니다. 당사 플랫폼의 200여 벡터 시스템은 광범위한 R&D 작업을 통해 최적화되었으며, 모든 벡터는 in vitro 및 가능한 in vivo 테스트를 통해 검증되었습니다. 경쟁력 있는 가격과 빠른 처리시간을 갖는 VectorBuilder에 클로닝을 아웃소싱하면, 실험실에서 직접(DIY) 하는 클로닝에 비해 시약 및 인건비 등의 비용 뿐 아니라 클로닝과 관련된 시간과 노력 그리고 어려운 클로닝에 의해  좌절하게 되는 경험 등을 줄일 수 있습니다.DNA 벡터의 클로닝 외에도 plasmid DNA 정제, 바이러스 패키징 (렌티바이러스, AAV, 아데노바이러스, MMLV, baculovirus, 등), Library 제작, BAC DNA 재조합, 염기 서열 변이, 안정한 세포주 생성 및 RNA 정제와 같은 많은 관련 서비스를 제공합니다.

서비스 중점 사항

  • 매우 직관적인 무료 온라인 Vector Design Studio 를 사용하여 다양한 목적과 용도의 맞춤형 벡터를 빠르게 디자인할 수 있습니다.
  • 방대한 벡터 backbone 및 벡터 구성 요소 목록을 이용하여 클로닝에 소요되는 시간과 비용을 절약할 수 있습니다 (당사 프로젝트의 약 20% 만이 새로운 유전자 합성을 필요로 함).
  • 기능적으로 검증된 벡터 backbone 및 구성 요소를 사용함으로써 신뢰할 수 있는 실험 결과를 얻을 수 있게 합니다.
  • 단순한 디자인부터 복잡한 디자인까지 벡터를 생성하기 위한 다양한 클로닝 기술을 활용합니다.
  • 까다로운 벡터 클로닝에 대한 광범위한 경험과 노하우를 보유하고 있습니다.
  • Plasmid DNA 정제바이러스 패키징과 같은 downstream 서비스를 쉽게 제공받을 수 있습니다.
  • 100% 정확한 벡터의 염기서열을 보장합니다.
  • 최대 6개월 동안 무료로 벡터 보관합니다.
  • 맞춤형 벡터의 지적재산권은 고객이 소유합니다.

서비스 세부 사항

가격 및 소요시간

전형적인 맞춤형 벡터 클로닝의 워크플로우는 고객이 제공한 시료의 QC (해당되는 경우), 필요한 벡터 구성 요소의 확보 (해당되는 경우), 실제 벡터 클로닝의 세 부분으로 구성됩니다. 가격 및 소요시간에 대한 간략한 개요는 아래의 Table 1에 나와 있습니다.

Table 1. 맞춤형 클로닝의 가격 및 소요시간에 대한 개요

Vector cloning* Vector component sourcing (if applicable) QC of customer-supplied materials (if applicable)
Type

벡터 디자인의 복잡한 정도에 따라 다름

벡터 template를 보유하고 있는 경우 고객이 벡터 template를 제공하는 경우 새로 합성하는 경우 시료가 벡터 backbone인 경우 시료가 벡터의 구성 요소인 경우
Price

a. shRNA, gRNA, 또는 enhancer, promoter와 같은 작은 DNA 발현: >$99

b. 단백질 발현: >$159

80% 이상의 templates에 대해서 $0-$50 $0 Table 3을 참고하시기 바랍니다 $150 >$120

Turnaround**

80% 이상의 project의 경우 1-3 주 바로 제공 가능함 QC 이후에 바로 제공 가능함 Table 3을 참고하시기 바랍니다 3-5 일
Description PCR, ligation에 의한 cloning, Gibson assembly, Gateway 또는 Golden Gate cloning 에 의한 클로닝 방법들이 포함됩니다. Promoter, ORF, marker, linker, protein tag 들을 보유하고 있습니다. 약 20%의 project들의 경우에 새로 유전자를 합성하는 일이 필요합니다. 정량, re-transformation, plasmid 정제, 제한효소 처리, Sanger sequencing 등이 QC에 포함됩니다.

주:

* VectorBuilder의 표준 벡터 backbone 및 구성 요소들로 제작된 벡터는 아래 Table 2에서와 같은 동일한 가격과 소요시간이 적용됩니다.

** 클로닝 소요시간은 벡터 제조 시작부터 완료까지의 시간을 의미합니다. 고객이 제공한 시료의 운송 시간과 QC, 최종 결과물을 고객에게 배송하기 위한 운송 시간은 포함되지 않습니다.

Table 2. 단순 디자인 벡터의 가격 및 소요시간

Vector Type Price Turnaround
shRNA vector $99 7-12 일
gRNA vector (single-gRNA) $99 6-11 일
gRNA vector (dual-gRNA) $299 10-17 일
Expression vector $159 7-13 일

Table 3. 유전자 합성의 가격 및 소요시간

Fragment length Price (USD)* Turnaround
<1.5 kb $0.12/bp 6-10 일
1.5-3 kb $0.14/bp 10-14 일
3-5 kb $0.16/bp 10-16 일
5-7 kb $0.18/bp 16-20 일

* 1) GC 함량이 높거나, 단순 반복 또는 부분 반복 등 합성이 어려운 서열이 포함된 경우, 2) 합성해야 하는 DNA fragment가 3개 미만인 경우에 유전자 합성 가격은 올라갈 수도 있습니다.

결과물

기본 형식은 소량의 plasmid DNA 로 제공됩니다. Miniprep (> 10ug), Midiprep (> 100ug), Maxiprep (> 300ug), Megaprep (> 1mg) 및 Gigaprep (> 10mg) 등 여러 스케일의 고품질 plasmid DNA 를 추가로 구입할 수도 있습니다. 바이러스 벡터의 경우 다양한 스케일의 바이러스 패키징 이 downstream 서비스로 제공됩니다.

품질 관리 (QC)

VectorBuilder에서 클로닝한 모든 벡터는 100% 정확한 서열을 보장합니다. 당사의 벡터는 디자인한 대로 정확한 서열을 포함하도록 엄격한 품질 관리를 받습니다. 일반적인 QC에는 DNA 정량, A260/280 측정, 제한효소 처리하지 않은 또는 제한효소로 처리한 plasmid DNA의 전기영동, Sanger 시퀀싱, glycerol stock에서 박테리아 회수 및 re-transformation 등이 포함됩니다.

고객이 제공하는 시료

Backbone이나 유전자 template 등 고객이 제공하는 시료가 필요한 경우 "서포트" > "시료 제출 양식" 에서 시료의 정보를 제공해 주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며, 아이템 유형 및 용도에 따라 항목당 $120 이상의 추가 QC 요금이 발생할 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다.

자주 묻는 질문

VectorBuilder에서 벡터 클로닝 서비스를 위해서 어떤 방법들을 사용합니까?

VectorBuilder에서는 고객의 요구에 따른 맞춤형 벡터를 만들기 위해서 다양한 분자생물학적 기법들을 결합해서 사용합니다. 당사의 고속 클로닝 플랫폼을 이용하여 낮은 가격과 짧은 소요시간으로 제조하기 위하여, 유전자 발현 벡터들의 경우에는 일반적으로 Gateway cloning 또는 Gibson assembly를 이용하며, shRNA 와 gRNA 벡터들의 경우에는 ligation 에 의한 클로닝 방법을 이용합니다. 또한 project에 따라서 새로운 유전자 합성 및  Golden Gate 클로닝 등을 포함하는 다양한 방법들을 일상적으로 사용합니다.

VectorBuilder에서는 벡터 클로닝을 위하여 어떤 박테리아 균주를 사용합니까? Vectorbuilder에서 만들어진 plasmid를 유지 및 배양하기 위해서는 어떤 박테리아 균주를 사용해야 합니까?

Vectorbuilder에서 만들어진 모든 벡터는 높은 형질전환률(>1x109 cfu/ug)을 제공하며 동시에 반복되는 염기 서열과 같은 불안정한 부분을 포함하는 DNA plasmid를 안정하게 유지할 수 있는 당사에서 자체적으로 제작한 VB UltraStable을 사용하여 만들어집니다. 따라서 당사의 VB UltraStable chemically competent cells 을 사용하여 plasmid를 유지해주시기를 강력히 추천해드립니다. 하지만, 당사에서 제작된 벡터들은 일반적으로 사용되는 DH5α 나 Stbl3 같은 E. coli 균주에서도 유지될 수 있습니다.

Plasmid 정제 수율이 낮은 이유가 무엇입니까?
Plasmid의 low-copy origin of replication에 의하여 DNA 복제 시에 복제되는 수가 낮아서입니다.

박테리아 내의 plasmid copy 수는 plasmid의 origin of replication에 의하여 결정됩니다. 어떤 origin들은 고유의 copy 수가 낮습니다. Plasmid origin of replication의 copy 수를 확인해보시기 바랍니다. Low-copy plasmid의 경우에 충분한 양의 DNA를 얻기 위해서는 E. coli 배양의 양을 늘려서 plasmid 정제를 하시기 바랍니다.

Vectorbuilder에서 제공되는 plasmid들의 origin of replication들의 copy 수를 확인하시기 바랍니다.

Plasmid 정제 column의 수용 용량에 비해 박테리아 배양액의 부피가 너무 작습니다.

Plasmid 정제 column의 결합 수용 용량과 plasmid의 copy 수가 높은지 낮은지 확인하시기 바랍니다. Mini prep의 경우에 overnight으로 배양한 1-5 ml의 박테리아 배양액을 사용하기를 권장합니다. Maxi prep의 경우, plasmid가 high-copy이면 100-150 ml, plasmid가 low-copy이면 300-500 ml의 overnight 배양한 박테리아 배양액을 사용하시기를 권장합니다. 일반적으로 high-copy plasmid의 경우에는 mini prep으로 1 ml 당 5 ug 정도의 plasmid를 얻을 수 있으며, 150 ml 에서는 500 ug 정도의 plasmid DNA를 얻을 수 있습니다. pET 계열의 plasmid 처럼 Low-copy plasmid인 경우, mini prep으로 1 ml 당 1.5-2.5 ug of plasmid DNA를 얻을 수 있으며, 150 ml 에서는 150-200 ug 의 plasmid DNA를 얻을 수 있습니다.

액상 배양한 박테리아 중 일부에서만 plasmid가 들어 있습니다.

항생제들 중에서 특히 ampicillin 과 같은 항생제는 액상 배양에서 빨리 분해가 됩니다. 그 결과로 배양된 박테리아의 상당한 수가 plasmid를 포함하지 않은 채로 자라게 되고, plasmid 정제 수율을 떨어뜨리는 이유가 됩니다. 이러한 경우를 피하기 위해서는 ampicillin을 포함하는 배양액을 배양 직전에 만들어서 사용하고, 충분한 ampicillin을 넣었는지 확인한 후에 사용하시기 바랍니다. 또한 ampicillin 저항성을 가지는 박테리아를 배양할 때에는 배양된 박테리아를 회수할 때까지 너무 오래 배양해서 포화상태에 들어가지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 배양액에 항생제가 충분하기 않은 이유 외에도 배양한지 오래된 박테리아 배양액에서 plasmid DNA를 정제하는 경우에도 죽은 박테리아 내에 존재하는 분해된 plasmid로 인해서 수율이 감소할 수도 있습니다. 따라서, 항상 새로 배양한 박테리아에서 plasmid를 정제하는 것이 좋습니다. 배양 후에 plasmid 정제를 바로 할 수 없는 경우에는, 박테리아를 원심분리로 침전시켜서 pellet 상태로 -80°C freezer에 저장했다가 나중에 정제하는 것이 좋습니다.

E. coli stab culture에서 바로 액체 배지로 접종한 후에 액상 배양을 했습니다.

Vectorbuilder에서 받으신 E. coli liquid stock이나 stab culture에서 바로 액체 배지로 접종하는 경우에 종종 낮은 plasmid 정제 수율이 얻어집니다. 먼저 박테리아를 항생제를 포함하는 LB agar plate에 streaking 방법으로 도말한 후에 agar plate에서 자라는 콜로니를 액체 배지에 접종하여 배양하시기를 추천합니다. 자세한 방법은 Resources 메뉴에 있는 '문서 자료 > 사용 설명서 > Stab Culture' 에서 보실 수 있습니다.

Plasmid prep kit의 manual을 주의 깊게 따라하지 않았습니다.

Plasmid 정제를 위하여 kit를 사용하시는 경우, 시작하시기 전에 manual을 주의 깊게 잘 읽어보시기 바랍니다. 종종 부적절한 방법에 의하여 kit의 정제 효율이 크게 떨어지기도 합니다.

저품질의 Mini / Maxi prep column 을 사용하였습니다.

어떤 브랜드의 plasmid DNA prep column들은 사용했을 때 정제 수율이 낮거나, 일관되지 않은 수율을 얻는 경우도 있습니다.