CRISPR Library 제작
VectorBuilder는 대규모 기능적 스크리닝에 대한 다양한 요구를 충족하도록 디자인된 고품질 CRISPR 라이브러리 제작을 전문으로 합니다. CRISPR 라이브러리는 E. coli 스톡, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스 형식으로 제공될 수 있습니다. VectorBuilder는 NGS를 통해 맞춤형 라이브러리를 철저히 검증하여, 제공되는 제품의 구성과 품질에 대한 정확한 통찰력을 제공합니다.
중점 사항
- 광범위한 복잡성 (complexity): 수백에서 최대 106까지의 복잡성을 지닌 CRISPR library를 생성할 수 있습니다.
- 다양한 CRISPR 기술의 축적된 경험: CRISPR 녹아웃(단일 또는 이중 gRNA), CRISPRa, CRISPRi, 단일 세포 CRISPR 기술, CRISPR 바코드 기술과 같은 모든 종류의 스크리닝 기술을 이용한 라이브러리 구축에 대한 광범위한 경험을 보유하고 있습니다.
- 벡터 디자인의 고객 맞춤 가능: 전달 시스템, 프로모터, 마커, 바코드 등에 대한 고객의 요구 사항에 대한 맞춤형 벡터 디자인이 가능합니다.
- 고품질의 바이러스 패키징: 다양한 바이러스 패키징을 빠르고 저렴한 가격으로 제공합니다.
- 뛰어난 coverage와 높은 균일성 (uniformity): 당사 라이브러리는 일반적으로 디자인된 gRNA의 98%가 넘는 적용 범위를 달성합니다.
서비스 세부 사항
가격 및 소요시간 Price Match
Table 1. 서비스 항목별 가격 및 소요시간
| Service Module | Brief Description | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|
| Library 디자인 | CRISPR 스크리닝을 위한 벡터 백본 설계 및 타겟 유전자/영역에 대한 gRNA 서열 디자인. | Free | 1-4 days |
| Pooled library 클로닝 (oligo 합성과 NGS 검증 포함) |
gRNA 합성, gRNA를 원하는 벡터 백본으로 대규모의 병렬 클로닝, Sanger 시퀀싱을 통한 예비 검증, NGS를 통한 전체 검증이 포함됩니다. 결과물로 E. coli 스톡의 라이브러리와 NGS 보고서가 제공됩니다. 자세한 내용은 아래 Table 2를 참조하세요. |
||
| Pooled library의 바이러스 패키징 | 바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 정보는 여기를 클릭하십시오. 라이브러리 패키징 가격은 단일 벡터 패키징 가격의 1.5배입니다. | ||
| 스크리닝 후 샘플의 NGS deconvolution | 스크리닝된 세포의 게놈 DNA에서 NGS 라이브러리 준비, Illumina 시퀀싱(>500x coverage) 및 데이터 분석이 포함됩니다. | From $320 per sample | 3-5 weeks |
Table 2. Library 복잡성에 따른 library 클로닝 가격
| Library Complexity | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|
| Single-gRNA | ||
| <5x103 | From $2,300 | 5-8 weeks |
| 5x103 ~ 1x104 | From $4,500 | |
| 1x104 ~ 5x104 | From $5,500 | 6-10 weeks |
| 5x104 ~ 1x105 | From $7,500 | |
| >1x105 | Please inquire | |
| Dual-gRNA | ||
| <5x103 | From $3,300 | 9-13 weeks |
| 5x103 ~ 1x104 | From $6,500 | |
| 1x104 ~ 5x104 | From $8,000 | |
| 5x104 ~ 1x105 | From $10,000 | |
| >1x105 | Please inquire | |
기술적인 정보
CRISPR 스크리닝 전략
풀링된CRISPR 라이브러리는 특정 경로, 질병, 약물 치료에 대한 세포 반응, 발달 과정, 유전자 조절 등과 관련된 코딩 또는 논코딩 영역에 대한 대규모 또는 게놈 차원의 기능적 스크리닝을 수행하기 위한 강력한 도구입니다. 아래 Table 3은 일반적으로 사용되는 CRISPR 기반 스크리닝을 비교했습니다.
Table 3. CRISPR 스크리닝 접근법 비교
| Screening Strategy | Mechanism | Target Location | Application |
|---|---|---|---|
| CRISPR KO | 야생형 Cas9이나 Cas9 nickase는 DNA를 절단하는데 사용됩니다. 세포가 DNA 손상을 복구하려고 시도하면 랜덤 돌연변이가 타겟 부위에 도입될 수 있습니다. | 주로 코딩 영역 | 주로 코딩 유전자의 기능적 스크리닝을 위해 적용 |
| CRISPRa | 전사 활성제(예: VP64)에 융합된 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9)는 표적 부위에 의해 조절되는 유전자를 활성화하는데 사용됩니다. | 일반적으로 프로모터 영역과 기타 논코딩 조절 영역 | 코딩 유전자의 기능 획득 스크리닝 또는 논코딩 영역의 조절 기능 스크리닝 |
| CRISPRi | 전사 억제인자(예: KRAB)에 융합된 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9)는 표적 부위에 의해 조절되는 유전자를 억제하는데 사용됩니다. | 일반적으로 프로모터 영역 및 기타 논코딩 조절 영역 | 코딩 유전자의 기능 상실 스크리닝 또는 논코딩 영역의 조절 기능 스크리닝 |
실험 데이타
Figure 1. VectorBuilder에서 구축한 CRISPR library의 복잡성, coverage 및 정렬비율(alignment rate). (A) Library complexity 범위는 102 에서 >105 까지입니다. (B) gRNA 적용 범위와 정렬 비율이 모두 매우 높아 라이브러리의 탁월한 적용 범위와 낮은 오류율이 강조되었습니다.
Figure 2. 7.7x104 gRNA로 구성된 풀링된 라이브러리의 gRNA 표현 분포. gRNA 리드수(read count)는 NGS 라이브러리 크기(1,000만 개 reads)에 따라 환산되었으며 log2 scale로 표시되었습니다. NGS sequencing depth는 300x였습니다.
주문 방법
고객이 제공하는 library plasmid pool
고객이 제공하는 플라스미드 풀을 사용하는 경우 시료 제출 가이드라인에 따라 준비하여 보내주십시오. 시료의 손상이나 배송 지연을 방지하려면 배송 가이드라인을 따라 주시기 바랍니다. 고객이 제공하는 시료는 당사의 필수 QC를 거치며 각 항목에 대해 추가 $100의 요금이 부가될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료는 QC를 통과한 후 생산이 시작됩니다. 고객이 제공한 플라스미드 풀에 대해서는 라이브러리의 복잡성이나 균일성에 대해 보장하지 않습니다.
FAQ
이중 gRNA 라이브러리는 녹아웃 스크린을 위한 단일 gRNA 라이브러리보다 훨씬 더 강력합니다. 왜냐하면 이러한 라이브러리에 의한 대규모 삭제 도입은 기능 상실 돌연변이 생성에 훨씬 더 높은 효율성을 가질 수 있기 때문입니다. 이중 gRNA 라이브러리의 각 CRISPR 벡터에는 동일한 유전자를 표적으로 하는 한 쌍의 gRNA가 포함되어 있습니다. Cas9 발현 세포에 도입되면 각 벡터는 동일한 표적 유전자에 대해 두 개의 절단을 생성할 수 있습니다. 두 절단 부위의 부러진 끝 부분을 복구하려는 세포의 시도는 일반적으로 두 부위에 걸친 대규모 삭제로 이어집니다. 두 개의 절단 부위는 표적 유전자의 기능적으로 중요한 영역 측면에 위치하도록 설계되어 이들 부위에 걸친 결실이 유전자 기능의 손실을 초래할 가능성이 높습니다.
일반적인 녹아웃 스크린의 경우 풀링된 CRISPR 라이브러리는 1-벡터 또는 2-벡터 시스템 형식으로 구성될 수 있습니다. 1-벡터 시스템에서는 Cas9 또는 Cas9 변이체가 동일한 벡터의 gRNA와 함께 발현되는 반면, 2-벡터 시스템에서는 Cas9 또는 Cas9 변이체와 gRNA가 두 개의 별도 벡터에서 발현됩니다. 대안적으로, 2-벡터 시스템에서 gRNA 발현 벡터는 Cas9를 안정적으로 발현하는 세포주에 도입될 수 있습니다. 1-벡터 시스템 사용의 장점은 두 개의 서로 다른 벡터가 세포로 공동 형질감염/형질도입되는 것을 방지하고 Cas9 발현 안정 세포주의 가용성에 국한되지 않는다는 것입니다. 그러나 2-벡터 시스템에 비해 다용도가 낮고 복제 및 바이러스 패키징 효율성이 떨어질 수 있습니다.
VectorBuilder는 CRISPR 라이브러리 디자인(CLD)에 사용된 algorithm을 따라 gRNA의 특이성 점수를 계산합니다. 간단히 말하면, 종의 N(20)NGG 서열을 표적으로 삼도록 의도된 주어진 gRNA에 대해 우리는 해당 종의 게놈에서 표적 서열과 3 이하의 불일치가 있는 모든 잠재적인 비표적 부위를 검색합니다. 이러한 방식으로 식별된 각각의 잠재적인 표적 이탈 부위에 대해 단일 표적 이탈 점수가 계산됩니다. 그런 다음 모든 비표적 사이트에 대한 점수를 종합적으로 사용하여 gRNA의 최종 특이성 점수(0~100)를 계산하며, 값이 높을수록 표적 특이성이 높다는 것을 나타냅니다.
특이성 점수는 대략적인 가이드일 뿐이라는 점에 유의하십시오. 실제 타겟팅 효율성과 특이성은 점수가 예측하는 것과 다를 수 있습니다. 점수가 낮은 gRNA도 잘 작동할 수 있습니다.