AAV Capsid Evolution

재조합 adeno-associated virus (AAV)는 광범위한 tropism, transgene 장기적 발현, 비병원성 및 낮은 면역원성 때문에 광범위한 유전자 치료 및 백신 응용 분야에서 널리 사용되는 유전자 전달 벡터이다.

그러나 기존 AAV serotype의 몇가지 문제는 치료 잠재력을 제한한다. 첫째, 사용 가능한 serotype은 선택할 수 있는 다양한 tropism을 제공하지만 많은 임상 응용에는 적용 범위를 벗어나는 조직 특이성이 필요하다. 둘째, 치료 대상 조직이 하나 이상의 serotype의 tropism을 포함하더라도 유전자 전달 효율이 너무 낮을 수 있고 off-target 조직에 대해 바람직하지 않은 tropism이 있을 수도 있다. 셋째, 많은 AAV serotype에 대한 이미 존재하는 중화 항체는 초기에 또는 반복된 약물 투여로 효율적인 전달을 차단할 수 있다. 마지막으로, 일부 serotype은 본질적으로 높은 titer, 순도 및 안정성으로 제조하기가 어렵다. 이러한 한계를 극복하기 위해 AAV capsid 엔지니어링은 개선된 기능을 갖춘 새로운 AAV variants의 개발을 가속화하는 중요한 연구 영역이다.

Directed evolution은 향상된 생체 분자를 엔지니어링하기 위해 널리 사용되는 high-throughput  방식이다. 이는 반복되는 유전적 다양화와 선택을 통해 자연선택의 과정을 모방한다. AAV capsid의 directed evolution은 야생형 AAV capsid 유전자를 돌연변이 시켜 매우 다양한 AAV capsid library를 생성하고, 그런 다음 이를 스크리닝하여 개선된 특성을 갖는 새로운 capsid variants를 찾아낸다. Directed evolution은 단백질의 구조-기능 관계에 대한 사전 지식을 필요로 하지 않기 때문에 AAV capsid 엔지니어링을 위한 합리적인 디자인보다 선호되는 경우가 많다.

 

Service Highlights

  • Full-service platform: VectorBuilder는 모든 AAV 전임상, 임상 CRO 및 CDMO 니즈에 대한 원스톱 솔루션을 제공할 수 있는 세계 유일의 회사이다. AAV 서비스에는 vector design 및 optimization, vector cloning, library construction, virus packaging, capsid evolution 및 targeted engineering, AAV biodistribution profiling 및 GMP 제조가 포함된다. 
  • High complexity capsid library construction via versatile approaches: Pooled library 제작에 대한 광범위한 전문 지식을 통해 directed evolution 방법 또는 조합된 방법을 통해 매우 다양한 capsid library 를 디자인하고 커스텀 제작이 가능하도록 지원한다.
  • High titer capsid library virus packaging: Capsid library의 one-step또는 two-step 바이러스 패키징을 수행하여 각 바이러스 입자가 게놈에 해당 capsid variant를 포함하도록 하고 높은 바이러스 titer를 달성할 수 있다.
  • In vivo screening in multiple species including nonhuman primate (NHP): In vitro 스크리닝 외에도 in vivo 스크리닝 플랫폼에서 mouse, rat, 그리고 중요하게는 두가지 비인간 영장류 종인 crab-eating macaque (Macaca fascicularis; cynomolgus monkey라고도 함) 및 rhesus macaque (Macaca Mulatta)와 같은 다양한 종을 제공한다. in vivo 스크리닝은 고도로 훈련된 전문가에 의해 AAALAC 인증 시설에서 수행된다.
  • Full technical support: 경험이 풍부한 당사의 과학자들은 library 제작에서 in vivo 스크리닝, library 디자인에서 NGS 분석에 이르기까지 AAV capsid프로젝트의 모든 측면을 커버하는 포괄적인 기술 지원을 제공할 수 있다.

Workflow of Capsid Evolution and Screening

AAV capsid evolution의 전체 워크플로우에서 첫번째이자 가장 중요한 단계는 각 벡터가 rep 유전자와 cap 유전자 변이체로 구성된 chimeric AAV 게놈을 운반하는 매우 다양한 AAV transfer vector library를 생성하는 것이다. Capsid 유전자 변이체는 error-prone PCR, random peptide display, DNA family shuffling 또는 in silico design과 같은 directed evolution 방법을 사용하여 효율적으로 생성할 수 있다. 그런 다음 transfer vector library를 바이러스 입자로 패키징하고 각 바이러스 입자는 게놈에 해당 capsid 변이체를 보유한다. Library에서 pooled viruses는 이후 chimeric AAV의 능력을 테스트하기 위한 스크리닝 과정을 거친다: 1) 특정 조직이나 기관 내에서 타겟 세포에 효율적으로 transduction하는지, 2)  높은 affinity으로 세포 유형 특이적 수용체에 결합하는지, 3) 중화 항체를 회피하는지를 테스트 한다. 스크리닝을 통과한 바이러스 게놈은 타겟 세포에서 회수되어 2차 스크리닝을 위해 더 작은 library로 만들어진다. 높은 신뢰도의 변이를 풍부하게 하기 위해 일반적으로 여러 차례의 선택이 수행된다. 생선된 클론은 강화된 특성을 갖는 새로운 AAV capsid 변이체를 식별하기 위해 검증되고 특징지어진다 (Figure 1).

Figure 1. Typical workflow for screening novel AAV capsids by directed evolution.
Capsid library construction

아래에 설명된 directed evolution전략은 일반적으로 pooled AAV capsid variants를 생성하는데 사용된다. 그런 다음, 스크리닝을 위한 capsid library는 capsid variants를 AAV 벡터에 대량으로 클로닝하여 chimeric AAV 게놈(각각 rep 유전자 및 cap variant로 구성됨)을 형성함으로써 구성된다.

Error-prone PCR

Error-prone PCR은 AAV capsid 유전자를 돌연변이 시키기 위한 표준 PCR 방법의 변형을 포함하는 매우 가변적인 AAV capsid library를 개발하기 위한 가장 간단한 방법이다. 보다 구체적으로, error-prone PCR은 AAV capsid유전자에 random point mutations을 도입하기 위해 low fidelity polymerases, 더 긴 extension 시간, 더 높은 Mg2+ 농도, Mn2+ 추가 및 다양한 dNTP 농도를 포함하는 다양한 차선의 PCR 조건의 조합을 사용한다.

Random peptide display

Random peptide display는 바이러스의 자연적인 세포 상호작용을 변경하고 이를 특정 세포 수용체로 재타켓팅할 목적으로 AAV capsid의 특정 부위에 일반적으로 7~9개 아미노산의 무작위 펩타이드 서열을 삽입하는 것을 포함한다. 펩타이드는 일반적으로 펩타이드의 표면 노출을 촉진하고 또한 바이러스-호스트 상호작용에 중요한 AAV capsid의 위치에 삽입된다. 예를 들어, AAV2 capsid의 587과 588 사이(variable region VRIII 내)는 대부분의 AAV2-based peptide display library에 선호되는 삽입 부위이다. 해당 영역에 펩타이드를 삽입하면 AAV2의 heparan sulfate proteoglycan (HSPG, the primary AAV2 receptor) motif 가 제거되고, 표시된 펩타이드가 세포 표면 분자와 효율적으로 상호작용할 수 있다.

DNA family shuffling

DNA family shuffling은 상이한 AAV serotype에서 유래된 부모 capsid 유전자의 분자 교배에 의해 chimeric AAV capsid를 생성하기 위한 매우 효율적인 접근 방식이다. 이를 달성하기 위해 다양한 AAV serotype의 부모 capsid유전자를 단편화한 다음 부분 서열 상동성을 기반으로 이들을 재조합하는 primer-less PCR에 의해 새로운 full-length capsid 변이체로 재결합한다. 대안 전략으로, 합리적인 디자인(AAV 생물학에 대한 사전 지식을 기반으로 capsid 변형)을 directed evolution과 결합하는 synthetic shuffling에 의해 고도로 복잡한 library를 생성할 수도 있다. 이 방법에서는 mutagenesis에 적합한 capsid위치를 먼저 확인하고, 자연 발생 AAV serotype의 상세한 구조 및 서열 분석을 기반으로 평가한다. 돌연변이를 포함하는 단편을 합성하고 결합하여 신규 full-length capsid 변이체가 형성한다.

In silico design

AAV capsid library의 in silico디자인은 AAV 성능 향상에 기여할 수 있는 capsid 변이체 서열의 계산 예측을 위한 다양한 방법을 활용한다. 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 추정되는 조상 AAV library 의 in silico 디자인을 포함하는 조상 재구성이며, 그 다음 개선된 tropism을 갖는 매우 강력한 조상 capsid 서열을 식별하기 위한 실험적 검증이 뒤따른다. 이 방법의 근거는 자연선택 과정에서 살아남은 진화적 AAV 중간체가 바이러스 구조와 기능을 유지하면서 고유한 특성을 가질 가능성이 높다는 것이다. Machine learning은 가상의 capsid 변이체로부터 생존 가능한 바이러스 생산 가능성을 예측하기 위해 계산 알고리즘을 적용하는 in silico 디자인 방법에서 일반적으로 사용되는 또 다른 방법이다. Machine learning알고리즘은 사용 가능한 입력 데이터에 크게 의존하여 단백질의 구조-기능 관계를 학습하고 이를 적용하여 바이러스 capsid 조립과 같은 복잡한 생리학적 과정의 결과를 예측한다.

Virus packaging of capsid library

Capsid library의 바이러스 패키징은 아래 설명된 대로 one-step또는 two-step프로세스로 수행할 수 있다.

One-step packaging of capsid library

AAV capsid library를 패키징하기 위한 기존 방법은 패키징 세포가 capsid library 및 adenoviral helper plasmid로 co-transfection하는 one-step 프로세스를 활용한다. 이 방법이 널리 사용되지만 cross-packaging (일치하지 않는 capsid 변이체 게놈 및 capsid 가 있는 AAV 파티클 생성) 및 capsid 모자이크 현상(다중 변이체에서 파생된 capsid 단백질에서 발생하는 모자이크 capsid가 있는 AAV 파티클 생성)의 단점이 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해 패키징 세포는 세포당 최대 하나의 단일 library plasmid의 흡수를 보장하기 위해 plasmid library 대비 매우 낮은 세포 수로 transfection하는 것을 권장한다.

Two-step packaging of capsid library

Two-step패키징 방법에서 capsid library는 먼저 야생형 cap 유전자를 인코딩하지만 바이러스 ITR이 없는 helper plasmid와 함께 패키징 세포에 co-transfection된다. 이로 인해 부분적으로 야생형 VP 단백질로 구성되고 AAV transfer shuttle로 지칭되는 모자이크 capsid가 있는 AAV 파티클이 생성된다. 그런 다음 AAV transfer shuttle은 세포당 최대 하나의 바이러스 입자를 얻기 위해 낮은 MOI로 패키징 세포에 도입되고, 이어서 패키징 세포를 야생형 adenovirus로 superinfection시켜 궁극적으로 높은 titer의 바이러스 capsid library를 생성한다.

Capsid screening in vitro and in vivo

바이러스 capsid library는 일반적으로 원하는 특성을 가진 chimeric AAV를 선택하기 위해 스크리닝 목적에 따라 in vitro 또는 in vivo에서 여러 차례의 선택을 거친다.

In vitro selection

AAV capsid library선택을 위해 확립된 세포주를 활용하는 것은 특히 수용체 타겟팅 능력이 변경된 AAV 변이체를 식별하는데 널리 사용되는 방법이다. AAV library의 in vitro 선택은 빠르고 기술적으로 간단하지만 몇가지 문제가 있다. 첫째, in vitro에서 높은 transduction 효율을 위해 최적화된 벡터는 in vivo에서 사용될 때 동일한 효율을 재현하지 못할 수 있다. 둘째, in vitro에서 높은 수준의 타겟 세포 특이성을 나타내는 AAV 벡터는 in vivo에서 translation될 때 비타겟 조직을 transduction 할 수 있다. AAV library의 in vitro 선택을 위한 또 다른 전략은 특히 면역 회피 특성을 가진 변이체를 식별하기 위해 library를 타겟 세포에 추가하기 전에 면역화된 동물의 강력한 혈청에 library를 적용하는 것을 포함한다. 그러나 AAV 변이체의 면역 반응은 다양한 요인으로 인해 in vivo에서 translation될 때 달라질 수 있다(예: 동일한 AAV 벡터의 면역 인식은 다른 경로를 통해 전달될 때 다를 수 있음).

In vivo selection

In vivo동물 모델은 AAV library를 스크리닝하기 위한 보다 안정적인 플랫폼을 제공하며, 특히 배양에서 성장할 수 없는 섬세한 세포 유형을 transduction 할 수 있는 AAV 변이체 또는 복잡한 조직 구조를 갖는 특정 세포 유형을 transduction 할 수 있는 AAV 변이체를 식별하기 위한 보다 안정적인 플랫폼을 제공한다. In vivo 선택은 또한 AAV 변이체와 관련된 잠재적인 off-target 효과를 식별하는 데 도움이 된다. 마우스와 NHP는 모두 AAV library의 in vivo 선택에 널리 사용되지만, NHP 모델은 인간과의 높은 유사성으로 인해 개선된 AAV 벡터를 스크리닝하기 위한 가장 임상적으로 적절한 플랫폼이다.