치료용 LNP 엔지니어링

Figure 2. LNP 제형은 in vitro에서 효율적인 plasmid transfection을 달성합니다. (A) EGFP를 과발현하는 plasmid (pDNA-CMV>EGFP)를 SM102 또는 ALC-0315 LNP로 encapsulation하여 HEK293T 세포에 transfection하였습니다. Transfection하고 24시간 후에 EGFP 발현을 관찰하였습니다. (B) 최적화된 SM102 기반 LNP 제형은 시판되는 PEI transfection 시약보다 HEK293T 세포에서 약 6.6배 더 높은 transfection 효율을 나타냈습니다. 리포터로는 firefly luciferase 발현 plasmid (pDNA-CMV>Fluc)를 사용하였습니다.

Figure 3. VectorBuilder에서 개발한 신규 LNP 제형은 in vivo에서 장기 지속 발현을 가능하게 합니다. Luciferase 발현 plasmid (pDNA-CAG>Luc+)를 이 새로운 LNP 내에 encapsulation한 후, 0.6 mg/kg (체중 대비) 용량으로 정맥 주사했습니다. Luciferase 발현은 주사 후 최대 96시간까지 검출되었습니다.

Figure 4. 최적화된 LNP 제형은 primary human T 세포에서 매우 효율적인 transfection을 가능하게 합니다. (A) 활성화된 (activated) T 세포에 1×10⁶ 세포당 6 μg mRNA로 LNP-encapsulated EGFP mRNA를 transfection하였습니다. (B) Encapsulation 전, 변성 (denaturing) 아가로스 겔 전기영동을 통해 EGFP mRNA의 정확한 길이와 온전성 (integrity)을 확인하였습니다. (C) T 세포 transfection 전, LNP의 입자 사이즈와 제타 전위 (Zeta potential)를 측정하였습니다. (D) Transfection하고 24시간에 형광 현미경과 flow cytometry를 이용하여 EGFP 발현을 관찰하고 분석하였습니다.

Figure 5. 신규 LNP 조성 (composition)은 in vivo 면역원성 (immunogenicity)을 현저히 감소시킵니다. 이 제형에서는 m1ψ가 도입된 HiExpress™ FLuc LNP-mRNA에 대해 PEG화된 지질 (PEGylated lipids)을 polysarcosine (pSar) 지질로 대체하였습니다. PEG-지질 (PEG-lipid) 제형과 함께 두 종류의 LNP-RNA를 정맥 주사하고 주사 후 6시간에 FLuc 발현을 이미징 하였습니다. 이후 주사 후 24시간에 혈청 내 두 가지 염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines)을 ELISA로 정량 분석하였습니다.

Figure 6. GalNAc 변형 (GalNac-modified) LNP는 간 특이적 타겟팅을 가능하게 합니다. (A) 동적 광산란법 (Dynamic Light Scattering, Zetasizer)을 이용한 GalNAc 및 SM102 지질 나노입자의 특성 분석. (B) GalNAc-LNP를 이용한 C57BL/6 Ldlr−/− 마우스에서의 mRNA의 효율적인 간 전달 (hepatic delivery). m1Ψ로 제조한 HiExpress™ Firefly Luciferase IVT mRNA를 GalNAc 또는 표준 SM102 기반 LNP로 encapsulation 하였습니다. 각 wild-type 또는 Ldlr knockout 마우스에 체중 kg당 0.5 mg의 encapsulation된 RNA를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였습니다. 주사 후 6시간 및 24시간에 라이브 이미징을 통해 luciferase 활성을 시각화 하였습니다.

Figure 7. Anti-CD31 conjugated FLuc LNP-mRNA는 폐에서 luciferase 발현을 향상시킵니다. 마우스 계통: C57BL/6J; 주령: 6-8주; 성별: 암컷; 투여 경로: 꼬리 정맥 주사 (intravenous tail vein injection). 음성 대조군: IgG2a-conjugated FLuc LNP-mRNA.

Figure 8. 항체 접합 (antibody-conjugated) LNP를 이용한 조직 특이적 mRNA 전달. (A) Cre 의존적 tdTomato 발현 카세트를 보유한 Ai9 마우스에 anti-CD31 항체가 접합되거나 접합되지 않은 LNP에 encapsulation된 Cre mRNA (0.4 mg/kg)를 정맥 주사하였습니다. (B) 주사 후 72시간에 폐에서의 tdTomato 발현을 관찰하였습니다.

Figure 9. 전장 항체 (full antibody) 및 F(ab’)2 접합 (conjugation)을 통해 폐 타겟팅 향상. Fluc LNP-mRNA는 anti-CD31 전장 항체 또는 F(ab’)2와 접합한 후 마우스 (n=3)에 정맥 주사로 투여하였습니다.

Figure 10. 부위 특이적 항체 접합 (site-specific antibody conjugation)을 통해 폐 타겟팅 향상. Fluc LNP-mRNA를 anti-CD31 전장 항체 (full antibody) 또는 scFv와 부위 특이적으로 접합한 (site-specifically conjugated) 후 마우스에 정맥 주사로 투여하였습니다.