shRNA Library 제작

VectorBuilder는 고품질의 맞춤형 풀링된 RNAi 녹다운 라이브러리를 제공하며 대규모 기능 상실(loss-of function) 스크리닝을 위한 강력하고 경제적이며 효율적인 솔루션을 제공합니다. shRNA 라이브러리는 E. coli 스톡, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스로 제공 가능합니다. VectorBuilder는 NGS를 통해 맞춤형 라이브러리를 철저히 검증하여, 제공되는 제품의 구성과 품질에 대한 정확한 통찰력을 제공합니다.

중점 사항

  • 광범위한 복잡성:수백에서 최대 10 6까지의 복잡성을 지닌shRNA library를 생성할 수 있습니다.
  • 벡터 디자인의 고객 맞춤 가능:전달 시스템, 프로모터, 마커, 바코드 등에 대한 고객의 요구 사항을 기반으로 한 고객 맞춤 벡터 디자인이 가능합니다.
  • 고품질의 바이러스 패키징:다양한 바이러스 패키징을 빠르고 저렴한 가격으로 제공합니다.
  • 뛰어난 coverage와 높은 균일성:당사 라이브러리는 일반적으로 설계된 gRNA의 98%가 넘는 적용 범위를 달성합니다.

서비스 세부 사항

landing page workflow
가격 및 소요시간   Price Match

Table 1. 서비스 단계별 가격 및 소요시간

Service Module Brief Description Price (USD) Turnaround
Library 디자인 shRNA 녹다운 스크리닝을 위한 벡터 백본 디자인 및 타겟 유전자에 대한 shRNA 서열 디자인. Free 1-4 days
Pooled library 클로닝 (oligo 합성과 NGS 검증 포함) shRNA 합성, shRNA를 원하는 벡터 백본으로 대규모 병렬 클로닝, Sanger 시퀀싱을 통한 예비 검증, NGS를 통한 전체 검증이 포함됩니다. 결과물로 E. coli glycerol stock의 library와 NGS 보고서가 제공됩니다. 자세한 내용은 아래 Table 2를 참조하세요.
Pooled library의 바이러스 패키징 바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 정보는  여기를 클릭하십시오. 라이브러리 패키징 가격은 단일 벡터 패키징 가격의 1.5배입니다.
스크리닝 후 샘플의 NGS deconvolution 스크리닝된 세포의 게놈 DNA에서 NGS library 준비, Illumina 시퀀싱(>500x coverage) 및 데이터 분석이 포함됩니다. From $320 per sample 3-5 weeks

Table 2. Library complexity에 따른 library클로닝 가격

Library Complexity Price (USD) Turnaround
<5x10 3 From $2,800 5-8 weeks
5x10 3~ 1x10 4 From $5,000
1x10 4~ 5x10 4 From $6,000 6-10 weeks
5x10 4~ 1x10 5 From $8,000
>10 5 Please inquire

기술적인 정보

풀링된 shRNA 라이브러리 매개 유전자 스크리닝의 워크플로우

풀링된 shRNA 렌티바이러스 라이브러리에 의해 매개되는 유전자 스크리닝의 기존 워크플로우는 아래 Figure 1에 나와 있습니다. 먼저, 관심 있는 세포를 shRNA 렌티바이러스 라이브러리로 형질도입하고, 양성으로 형질도입된 세포는 렌티바이러스 게놈의 마커 유전자(예: 약물 선택 또는 형광 마커)에 의해 선택됩니다. 다음으로, 양성으로 형질도입된 세포를 기준 집단과 실험 집단으로 나눕니다. 그런 다음 실험 집단에 특정 선택 압력(예: 약물 치료 또는 반복 계대 배양)을 적용하여 관심 표현형을 가진 세포를 식별합니다. 스크리닝 전략에는 세 가지 주요 유형이 있습니다: 1) 선택 압력에 노출되었을 때 생존 세포에서 풍부하거나 고갈된 shRNA를 검색하는 생존 가능성 스크리닝; 2) 높거나 낮은 리포터 발현과 관련된 세포에 풍부한 shRNA(예: 리포터 유전자 발현을 조절하는 전사 인자를 표적으로 하는 shRNA)를 찾는 리포터 스크린; 3) 일반적으로 세포 침입, 이동 등과 관련된 유전자에 영향을 미치는 shRNA를 식별하는 행동 스크리닝. 스크리닝 후 실험세포와 대조 세포를 모두 회수하고 Sanger 시퀀싱 또는 NGS를 사용하여 대조 그룹과 비교하여 실험 그룹에서 증가하거나 감소된 shRNA를 식별합니다. 농축되거나 고갈된 shRNA에 의해 잠재적으로 타겟이 되는 후보 유전자를 후속 기능 연구를 통해 추가로 조사할 수 있습니다.

picture3

Figure 1. 풀링된 shRNA 렌티바이러스 라이브러리에 의해 매개되는 기능손실(loss-of-function) 스크리닝의 워크플로우. Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012)에서 인용되었습니다.

실험 데이타
picture4

Figure 2.  human and mouse elite gene (~2,000 most frequently cited genes on PubMed Central) and whole genome pooled libraries. 에서 shRNA 표현 분포. shRNA 리드 수(read count)는 NGS 라이브러리 크기 (10 million reads)로 보정되고(normalize) log2 스케일로 표시되었습니다. 

주문 방법

고객이 제공하는 library plasmid pool

고객이 제공하는 플라스미드 풀을 사용하는 경우  시료 제출 가이드라인에 따라 준비하여 보내주십시오. 시료의 손상이나 배송 지연을 방지하려면 배송 가이드라인을 따라 주시기 바랍니다. 고객이 제공하는 시료는 당사의 필수 QC를 거치며 각 항목에 대해 추가 $100의 요금이 부가될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료는 QC를 통과한 후 생산이 시작됩니다. 고객이 제공한 플라스미드 풀에 대해서는 라이브러리의 복잡성이나 균일성에 대해 보장하지 않습니다 .

자료

FAQ
Array기반 RNAi 스크리닝 대비 풀링된 RNAi 스크리닝의 장점은 무엇입니까?
Array-based Screen Pooled RNAi Screen
shRNA가 목적세포로 어떻게 도입되나요? 개별 shRNA는 multi well plate(예: 96well 또는 384 well)의 서로 다른 well에서 성장한 세포에 적용됩니다. 수백, 수천 개의 서로 다른 shRNA가 세포 집단에 동시에 적용됩니다.
관심있는 표현형과 관련된 shRNA 식별 방법은 무엇입니까? 관심있는 표현형을 나타내는 well은 well별로 표현형을 검사하여 선택됩니다. 개별 well에 적용되는 shRNA정보는 이미 알려져 있습니다. 관심있는 표현형의 세포는 모집단으로부터 선별됩니다. 시퀀싱을 통해 관심 있는 세포에서 풍부하거나 고갈된 shRNA를 식별합니다.
유전적 상호작용을 감지할 수 있나요? No (단일 shRNA가 각 well에 추가되는 경우) 또는 제한적입니다(두 개 이상의 shRNA가 각 well에 추가되는 경우). Yes (세포는 무작위로 결합된 여러 shRNA를 보유할 수 있습니다).
기술적 편차 High Low
인건비와 시약비용 High Low
특수 장비 요구사항 High (e.g. liquid handler, high-throughput imaging, etc.) Low (conventional benchtop equipment)
shRNA 녹다운 점수는 어떻게 계산되나요?

VectorBuilder는 shRNA를 디자인하고 점수를 매기기 위해  RNAi consortium (TRC)에서 사용하는 것과 유사한 규칙을 적용합니다. 주어진 각 RefSeq transcript에 대해 후보 타겟 사이트로 간주 가능한 모든 21-mer를 검색합니다. 동일한 염기의 ≥4 실행, ≥7 G 또는 C 실행, GC 함량 <25% 또는 >60%, 및 5' 말단의 AA를 포함하여 녹다운 효율성/특이성 또는 복제 가능성을 감소시키는 기능을 포함하는 후보는 제외됩니다. 녹다운 점수는 내부 stem-loop, 3' 말단을 향한 높은 GC 함량, 알려진 miRNA 시드 서열 또는 다른 유전자에 대한 off-target 일치를 포함하는 후보에 대해 페널티를 부여합니다. 대체 전사물이 있는 유전자의 경우 모든 전사물에 존재하는 표적 사이트에 더 높은 점수가 부여됩니다.

모든 점수는 ≥0이고, 평균은 ~5이고, 표준 편차는 ~5이며, 95% 점수는 ≤15입니다. Knockdown 점수가 15 정도인 shRNA는 Knockdown 성능과 복제성이 가장 좋은 것으로 간주되는 반면, Knockdown 점수가 0인 shRNA는 Knockdown 성능이 가장 낮거나 복제하기 어렵습니다.

녹다운 점수는 대략적인 기준으로 실제 녹다운 효율성은 점수가 예측하는 것과 크게 다를 수 있습니다. 점수가 낮은 타겟 사이트가 잘 작동할 수도 있습니다. 또한 3' UTR을 타겟팅하는 것이 코딩 영역을 타겟팅하는 것만큼 효과적일 수도 있습니다.

주요 인용 논문

나의 벡터 디자인하기 디자인 서포트 의뢰하기