Adeno-Associated Virus (AAV) Packaging

재조합 adeno-associated virus (AAV)는 in vitro 및 in vivo 유전자 전달에 사용되는 다재다능하고 많이 사용되는 바이러스 벡터이다. AAV는 다양한 포유류 세포 유형에 transduction하는 능력과 인간에 비병원성 및 낮은 immunogenicity 때문에 유전자 치료에 가장 효과적인 수단 중 하나로 부상했다.

VectorBuilder는 AAV 기반 유전자 치료 실험을 지원하기 위해 최상의 품질의 AAV 패키징 서비스를 제공한다. 특히 당사는 벡터 클로닝 서비스에서 사용되는 AAV 벡터 시스템을 위해 titer, 순도, 효능 및 일관성 측면에서 재조합 AAV 생산 프로토콜을 크게 개선한 독점 기술과 시약을 개발했다. 그 결과 AAV 벡터 클로닝과 AAV 패키징에 대한 니즈에 만족하여 당사에 반복적으로 의뢰하는 고객들이 많아지고 있다. Research-grade AAV 외에도 임상 응용을 위한 GMP-grade AAV를 생산하여 제공하고 있다.

Types of AAV offered
  • Single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)
  • 18 serotypes: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF and AAV2.7m8

Service Details

Triple Transfection-Based Approach
Baculovirus-Based Approach
Price and turnaround
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >1012 GC/ml >2x1011 GC/ml 250 ul (10x25 ul) $399 10-18 days
Medium 1ml (10x100 ul) $599
Large >5x1012 GC/ml >2x1012 GC/ml 1ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo >2x1013 GC/ml >1013 GC/ml 100 ul (4x25 ul) $1,199 16-26 days
Ultra-purified medium 500 ul (10x50 ul) $1,799
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,799

Note:

1. GC = Genome copies.

2. Triple transfection-based approach is available for the following serotypes: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF and AAV2.7m8.

Deliverables
For non-ultra-purified scales For ultra-purified scales
Your custom AAV Your custom AAV

Free: control virus

  • Pilot: >2x1011 GC/ml, 100 ul
  • Medium: >2x1011 GC/ml, 2x100 ul
  • Large: >2x1011 GC/ml, 2x100 ul

  Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus

  • Ultra-purified pilot: >1013 GC/ml, 4x25 ul, at $400
  • Ultra-purified medium: >1013 GC/ml, 10x50 ul, at $600
  • Ultra-purified large: >1013 GC/ml, 10x100 ul, at $940
Control virus

Control AAV는 custom 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, AAV transduction을 테스트하는 데 사용된다. 예를 들어 custom 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control virus는 EGFP control AAV (AAV Overexpressing EGFP)이고, custom 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공된 control virus는 scramble shRNA를 발현한다. Control virus에 대한 자세한 정보는 다음과 같다.

Vector System Control Virus Vector Name Control Virus Vector ID
AAV gene expression system pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE VB190926-1395dab
AAV U6-based shRNA knockdown system pAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA VB180117-1020znr
AAV miR30-based shRNA knockdown system pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA:WPRE VB190813-1134mnj
AAV CRISPR system pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE VB190926-1395dab
Scale Application Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo >5x1013 GC/ml 1 ml (10x100 ul) $5,599 42-56 days
Ultra-purified medium 5 ml (25x200 ul) $20,199 49-63 days
Ultra-purified large 10 ml (50x200 ul) $38,199 56-70 days

Note:

1. GC = Genome copies.

2. Baculovirus-based approach is available for the following serotypes: 1, 2, 6, 8, 9.

Deliverables
Your custom AAV

  Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus

  • Ultra-purified pilot: >1013 GC/ml, 10x100 ul, at $1,870
  • Ultra-purified medium: >1013 GC/ml, 25x200 ul, at $6,740
  • Ultra-purified large: >1013 GC/ml, 50x200 ul, at $12,740
Control virus

Control AAV는 custom 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, AAV transduction을 테스트하는데 사용된다. 예를 들어 custom 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control virus는 EGFP control AAV (AAV Overexpressing EGFP)이고, control virus에 대한 자세한 정보는 다음과 같다.

Vector System Control Virus Vector Name Control Virus Vector ID
Chimeric baculovirus-AAV gene expression system pBV/AAV[Exp]-CMV>EGFP VB200825-1105uwz
Shipping and storage

AAV는 PBS buffer에 저장되어 있으며 드라이아이스로 배송된다. 수령 즉시, 장기보관을 위해서는 -80℃ (1년 이상 안정 가능) 또는 단기 보관을 위해서는 -20℃ (예: 2-3주)에서 보관하여야 한다. 해동된 AAV 바이러스는 1-2주 동안 4 °C에서 보관할 수 있다. AAV는 다른 많은 바이러스(예: Lentivirus)보다 안정성이 뛰어나고 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해 사이클은 피해야 한다. 

Technical Information

Triple Transfection-Based Approach
Baculovirus-Based Approach
AAV production and QC

당사의 재조합 AAV 제조의 경우 목적 유전자(GOI)를 운반하는 transfer plasmid는 HEK293T packaging cell로 AAV 복제를 매개하는 당사의 독점적인 Rep-cap plasmid와 adenovirus 유전자(E4, E2A, VA)를 인코딩하는 helper plasmid를 co-transfection 한다. 짧은 배양기를 거친 뒤 serotype에 따라 세포 serotype 또는 상청액에서 바이러스 입자를 채취하여 PEG precipitation에 의해 농축한다. Ultra-purified AAV(in vivo grade)의 경우 바이러스 입자를 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 더욱 정제하고 농축한다. 당사는 AAV titer를 측정하기 위해 qPCR 기반 방식을 사용한다.

Figure 1. Typical workflow of triple transfection-based AAV packaging.

VectorBuilder에서 생산하는 각각의 AAV에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 진균에 대한 멸균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있다. Transfer vector가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행한다. 또한 ultra-purified AAV의 경우 SDS-PAGE 분석 및 endotoxin 분석을 통해 virus 품질을 체크한다.

AAV production and QC

Baculovirus-based AAV 패키징 워크플로우는 아래 Figure 1과 같이 두가지 주요 단계로 구성된다. Step 1은 2 개의 재조합 baculovirus, 특히 AAV  inverted terminal repeats (ITRs) 측면에 있는 관심 유전자 (GOI)를 발현하는 baculovirus와 AAV rep 및 cap 유전자를 발현하는 두번째 helper baculovirus의 생성을 포함한다. Step 2에서 재조합 AAV 입자는 Step 1에서 생성된 2개의 재조합 baculovirus로 곤충 세포를 공동 감염시켜 생성된다.

2개의 재조합 baculovirus (하나는 AAV ITR 측면에 있는 GOI를 발현하고 다른 하나는 AAV rep/cap 유전자를 발현)를 생성하기 위해, 각 baculovirus에 대한 발현 카세트는 먼저 baculovirus transfer 벡터에 클로닝된다. Baculovirus transfer plasmid는 Tn7 transposase를 발현하는 helper plasmid와 함께 empty baculovirus shuttle vector (a.k.a. bacmid)가 있는 박테리아 숙주로 co-transformation되어 재조합 bacmid를 생성한다. 그런 다음 재조합 bacmid는 insect Sf9 세포로 transfection된다. 짧은 인큐베이션 기간 후, 바이러스 입자를 배지에서 수확하고, sucrose cushion centrifugation에 의해 추가로 농축한다. Baculovirus titer를 측정하기 위해 qPCR 방법을 사용한다. 그런 다음 두 재조합 baculovirus가 곤충 세포에 co-infection된다. 72-96 시간의 인큐베이션 기간 후, AAV 입자는 cell lysate뿐만 아니라 상청액으로부터 수확되고 PEG precipitation에 의해 농축된다. Ultra-purified AAV (in vivo grade)의 경우 바이러스 입자는 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 추가로 정제되고 농축된다. AAV titer를 측정하기 위해 qPCR 방법을 사용한다.

Figure 1. Typical workflow of baculovirus-based AAV packaging.

VectorBuilder에서 생산하는 각각의 AAV에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 진균에 대한 멸균 테스트, mycoplasma 검출이 있다. Transfer vector가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행한다. 또한 ultra-purified AAV의 경우 SDS-PAGE 분석 및 endotoxin 분석을 통해 virus 품질을 체크한다.

Experimental validation

VectorBuilder는 baculovirus-based AAV패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 독점 기술을 개발했으며, 바이러스는 포유류 세포에서 높은 transduction효율을 나타내는 것으로 검증되었다.

Figure 2. 293T cells were transduced with EGFP expressing, baculovirus-based AAV1 and AAV2 at MOI 10000. Magnification: 100x. Left: bright field. Right: GFP.

Recommended AAV serotypes
List by Serotype
List by Tissue Type
Serotype Tissue tropism
AAV1 Smooth muscle, CNS, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver
AAV2 Smooth muscle, CNS, liver, kidney, retina, inner ear
AAV3 Smooth muscle, liver, lung
AAV4 CNS, retina, lung, kidney
AAV5 Smooth muscle, CNS, lung, retina
AAV6 Smooth muscle, heart, lung, adipose, liver
AAV6.2 Lung, liver, inner ear
AAV7 Smooth muscle, retina, CNS, liver
AAV8 Smooth muscle, CNS, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9 Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney
AAVrh10 Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney
AAV-DJ Liver, heart, kidney, spleen
AAV-DJ/8 Liver, brain, spleen
AAV-PHP.eB CNS
AAV-PHP.S PNS
AAV2-retro Spinal nerves
AAV2-QuadYF Endothelial cell
AAV2.7m8 Retina, inner ear
Tissue type Recommended AAV serotypes
Smooth muscle AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10
CNS AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB
PNS AAV-PHP.S
Brain AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8
Retina AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8
Inner ear AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8
Lung AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10
Liver AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Pancreas AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10
Heart AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ
Kidney AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Adipose AAV6, AAV8, AAV9
Testes AAV2, AAV9
Spleen AAV-DJ, AAV-DJ/8
Spinal nerves AAV2-retro
Endothelial cells AAV2-QuadYF

* 목적 유전자(GOI)를 운반하는 ITR은 AAV2 게놈에서 가져온 것이다. 다른 serotype은 capsid protein serotype으로 구별된다.

Click here to view the amino acid sequence of the major viral capsid protein 1 (VP1) for different AAV serotypes >>
Technical documents
User Instructions Material Safety Data Sheet (MSDS) Certificate of Analysis (COA)

How to Order

Order both vector construction and virus packaging
Order virus packaging of your own vector

Customer-supplied vectors

If customer-supplied AAV plasmids are used in packaging, please send them to us following the Materials Submission Guidelines. Please strictly follow our guidelines to set up shipment to avoid any delay or damage of the materials. All customer-supplied materials undergo mandatory QC by VectorBuilder which may incur $100 surcharge for each item. Please note that production may not be initiated until customer-supplied materials pass QC.

FAQ

What features does AAV have comparing to other viral vectors?
Lentivirus MMLV Adenovirus AAV
Tropism Broad Broad Ineffective for some cells Depending on viral serotype
Can infect non-dividing cells? Yes No Yes Yes
Stable integration or transient Stable integration Stable integration Transient, episomal Transient, episomal
Maximum titer High Moderate Very High High
Promoter customization Yes No Yes Yes
Primary use Cell culture and in vivo Cell culture and in vivo In vivo In vivo
Immune response in vivo Low Low High Very low
How is viral titer determined in VectorBuilder?

We measure the physical titer of AAV by directly extracting viral genome from lysed viral particles, and then using qPCR to accurately quantify the copy number of viral genome (using the copy number of ITR region as a proxy) in the stock. Titration services using other methods (e.g. ddPCR, TCID50) can be purchased separately.

What is VectorBuilder's guarantee for virus titer and turnaround?

Our titer guarantee applies to vectors for which the region being packaged into virus (from 5’ ITR to 3’ ITR) is below the AAV cargo limit (4.7 kb). For sizes above this limit, the region packaged into the virus may be truncated and result in loss-of-function. Additionally, we may not be able to guarantee titer in the following situations:

  • Serotypes 4, 6 and DJ/8 which can only achieve 30-50% of the titer of the other serotypes.
  • Vectors containing sequences that could adversely affect the packaging process such as toxic genes (e.g. proapoptotic genes), genes that compromise the integrity of packaging cells or virus (e.g. membrane proteins that cause cell aggregation), and sequences prone to rearrangements or secondary structures (e.g. repetitive or highly GC-rich sequences).
  • Customer-supplied transfer plasmid containing undisclosed sequences or atypical ITRs that may introduce uncertainties to packaging efficiency.
  • Customer-supplied rep-cap plasmid and/or helper plasmid.

Our estimated turnaround is the time from production initiation to completion. It does not include waiting time for any customer-supplied materials (e.g. template DNA or viral vectors), QC of such materials, and transit time for shipping final deliverables to the customer.