Enhancer/Promoter Library 제작
VectorBuilder는 유전자 발현 조절 시 시스 조절 요소(cis-regulatory element)를 기능적으로 평가하기 위해 고도로 복잡한 enhancer/promoter라이브러리를 구축하는데 도움을 줄 수 있습니다. 일반적으로 enhancer/promoter라이브러리를 구축하는 것은 리포터 유전자의 상류 또는 하류에 시스 조절 요소를 배치하는 것을 포함하며, 리포터 유전자 전사체는 NGS에 의해 측정된 enhancer/promoter활성의 판독에 사용됩니다.
중점 사항
- 다양한 클로닝 전략: 귀하의 연구 목표에 맞춰 다양한 접근법을 사용하여 enhancer/promoter 라이브러리를 구축합니다.
- 높은 복잡성: 복잡성이 108 을 초과하는 enhancer/promoter 라이브러리를 생성할 수 있습니다.
- 최적화된 벡터 디자인: 당사의 벡터 디자인은 높은 signal-to-noise ratio를 나타내어 enhancer/promoter 스크리닝에서 흔히 발생하는 병목 현상을 해결합니다.
- 형광 리포터: 형광 리포터를 통합하면 시각화와 세포 분류가 모두 용이해 집니다.
- 바코드: 바코드를 통합하면 NGS 분석을 통해 업스트림 조절 요소의 전사 활동을 식별할 수 있습니다.
서비스 세부 사항
가격 및 소요시간 Price Match
| Service Module | Brief Description | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|
| Enhancer/promoter library 디자인 | 고도로 숙련된 과학자들로 구성된 VectorBuilder 팀은 검증된 백본의 높은 signal-to-noise ratio, 선택한 형광 마커 및 가변 바코드를 특징으로 하는 맞춤형 인핸서/프로모터 라이브러리를 디자인합니다. | Free | 1-4 days |
| Pooled library 클로닝 | 올리고/유전자 합성, 가변 영역 삽입물을 원하는 벡터 백본으로 대량 병렬 클로닝, Sanger 시퀀싱을 통한 예비 검증, NGS를 통한 전체 검증이 포함됩니다. 제공물에는 E. coli 스톡의 라이브러리와 NGS 보고서가 포함됩니다. | From $2,300 | 5-8 weeks |
| Pooled library의 바이러스 패키징 | 바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 정보를 보려면 여기를 클릭하십시오. 풀링된 라이브러리 패키징 가격은 단일 벡터 패키징 가격의 1.5배입니다. | ||
| 스크리닝 후 샘플의 NGS deconvolution | 스크리닝된 세포의 전체 RNA 또는 mRNA로부터 NGS 라이브러리 준비, Illumina 시퀀싱(>500x 적용 범위) 및 데이터 분석이 포함됩니다. | From $320 per sample | 3-5 weeks |
기술적인 정보
Enhancer/promoter 라이브러리 제작 전략
Chip-based oligo synthesis
칩 기반 올리고 합성은 다양한 크기와 서열로 사전 설계된 enhancer/promoter 변형체를 생성하는데 이상적입니다. 우리의 칩 기반 DNA 합성은 일반적으로 낮은 오류율로 최대 300nt까지 가능합니다.
Obtained from genomic DNA
Enhancer/mutation 라이브러리의 variable fragment는 probe hybridization을 통해 게놈 DNA 또는 BAC (bacterial artificial chromosome)으로부터 얻을 수 있습니다. 사전 설계된 프로브를 사용하여 게놈 서열 또는 BAC에서 추정 regulatory element를 포착하고 강화합니다. 또한 unbiased shotgun-type 접근 방식을 활용하여 게놈 DNA에서 잠재적인 regulatory element를 얻을 수 있습니다. 이어서, 이들 단편은 벡터 백본으로 클로닝하고 추가 특성화를 위한 스크리닝합니다.
Directed evolution from existing regulatory elements
Enhancer/promoter 라이브러리의 구성은 이러한 regulatory element의 기존 서열을 기반으로 할 수 있습니다. Error-prone PCR, degenerate codon활용 또는 DNA shuffling과 같은 다양한 돌연변이 유발 전략을 사용하여 새로운 variants를 생성합니다. 이러한 variants는 이후에 원하는 특성을 가진 변종을 식별하기 위한 스크리닝 프로세스를 거쳐 regulatory element의 targeted evolution을 촉진할 수 있습니다.
주요 구성요소
Enhancer library를 위한 벡터 디자인
Figure 1. Enhancer library를 위한 주요 벡터 구성요소.
Enhancer: 스크리닝 할 enhancer 서열을 리포터 유전자의 상류 또는 하류에 삽입할 수 있습니다. Enhancer가 리포터 유전자의 하류(A)와 poly A signal 앞에 위치하면 리포터 유전자와 함께 전사되므로 mRNA-seq로 직접 측정할 수 있습니다. 리포터 유전자의 상류(B)에 위치할 때 바코드 서열은 일반적으로 리포터 유전자의 3' UTR 영역에 통합되고 리포터 유전자로 전사될 수 있습니다. 바코드는 enhancer의 대리 역할을 하며 mRNA-seq로 서열을 분석할 수 있습니다.
Minimal promoter: 사용자가 선택한 minimal promoter 서열이 여기에 배치됩니다. 전사를 활성화하기 위해 enhancer가 존재하는 경우 이는 다운스트림 리포터의 전사를 유도합니다. 이러한 enhancer가 없으면 minimal promoter는 거의 완벽하게 비활성화됩니다.
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Kozak: Kozak 컨센서스 시퀀스. 이는 진핵생물에서 번역 개시를 용이하게 하는 것으로 생각되기 때문에 관심있는 ORF의 시작 코돈 앞에 배치됩니다.
Reporter: 시각적으로 검출 가능한 밝은 형광 단백질 유전자(예: GFP) 또는 화학발광 단백질 유전자(예: 루시퍼라제). 이를 통해 enhancer 활동을 매우 민감하게 감지할 수 있습니다.
Barcode: Enhancer 라이브러리 바코드는 개별 플라스미드 내의 고유하고 짧은 시퀀스입니다. 스크리닝 후 NGS 분석을 통해 각 바코드의 판독 횟수를 판별합니다. 고유한 바코드 서열을 특정 enhancer 변이체와 연관시킴으로써 특정 enhancer의 전사 활성을 확인할 수 있습니다.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. 이는 업스트림 ORF의 전사 종료를 촉진합니다.
프로모터 라이브러리를 위한 벡터 디자인
Figure 2. 프로모터 라이브러리를 위한 주요 벡터 구성요소.
Promoter: 스크리닝 할 프로모터 서열을 여기에 삽입하여 리포터의 전사를 구동할 수 있습니다.
Kozak: Kozak 컨센서스 시퀀스. 이 구성요소는 진핵생물에서 번역 개시를 용이하게 하는 것으로 생각되기 때문에 관심 있는 ORF의 시작 코돈 앞에 배치됩니다.
Reporter: 시각적으로 검출 가능한 밝은 형광 단백질 유전자(예: GFP) 또는 화학발광 단백질 유전자(예: 루시퍼라제). 이를 통해 프로모터 활동을 매우 민감하게 감지할 수 있습니다.
Barcode: 프로모터 라이브러리 바코드는 개별 플라스미드 내의 고유하고 짧은 시퀀스입니다. 스크리닝 후 NGS 분석을 통해 각 바코드의 리드수를 판별합니다. 독특한 바코드 서열을 특정 프로모터 변이체와 연관시킴으로써 특정 프로모터의 전사 활성을 확인할 수 있습니다.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. 이 구성요소는 업스트림 ORF의 전사 종료를 촉진합니다..
실험 데이타
Figure 3. Cone 특이적 프로모터 라이브러리 구축 및 스크리닝. (A) 실험 워크플로우. 새로운 변종은 알려진 광수용체 특이적 프로모터로부터 DNA 셔플링을 통해 생성되었습니다. 그런 다음 새로운 변종을 AAV 백본에 복제하여 GFP 리포터의 발현을 유도했습니다. AAV 프로모터 라이브러리를 마우스의 망막하 영역에 주입하였다. Cone 특이적 프로모터에 대한 스크리닝에는 형광 이미징, 세포 분류 및 NGS 시퀀싱이 포함되었습니다. (B)라이브러리의 망막하 발현 패턴. GFP를 구동하는 AAV 프로모터 라이브러리는 TdTomato를 구동하는 ProA1 프로모터를 운반하는 다른 AAV와 함께 주입되었습니다. ProA1은 알려진 Cone 세포 특이적 프로모터입니다. 빨간색과 녹색 형광의 공동 위치화는 프로모터 라이브러리에 Cone 특이적 프로모터가 존재함을 나타냅니다.
주문 방법
고객이 제공하는 library plasmid pool
고객이 제공하는 플라스미드 풀을 사용하는 경우 시료 제출 가이드라인에 따라 준비하여 보내주십시오. 시료의 손상이나 배송 지연을 방지하려면 배송 가이드라인을 따라 주시기 바랍니다. 고객이 제공하는 시료는 당사의 필수 QC를 거치며 각 항목에 대해 추가 $100의 요금이 부가될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료는 QC를 통과한 후 생산이 시작됩니다. 고객이 제공한 플라스미드 풀에 대해서는 라이브러리의 복잡성이나 균일성에 대해 보장하지 않습니다.