Enhancer/Promoter Library 제작

Library 디자인

아래 그림은 enhancer (Figure 1) 및 promoter (Figure 2) library에 대한 일반적인 벡터 디자인을 보여줍니다:

Figure 1. Enhancer library를 위한 주요 벡터 구성요소.

Figure 2. Promoter library를 위한 주요 벡터 구성요소.

Library 제작

Enhancer/promoter 단편은 보통 아래에 언급된 일반적인 접근법을 사용하여 얻을 수 있습니다:

In vitro/in vivo 스크리닝

Enhancer/promoter variants의 스크리닝은 in vitro 및 in vivo에서 수행될 수 있습니다. In vitro 선택은 일반적으로 신속하고 기술적으로 간단하지만, in vivo에서 발견되는 생리학적 조건을 복제할 수는 없습니다. In vivo 동물 모델은 향상된 전사 활성을 갖는 enhancer 및 promoter를 스크리닝하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 마우스와 NHP (non-human primates) 모두 enhancer/promoter library의 in vivo 선택에 활용되지만, NHP 모델은 유전자 치료제 응용 분야에 중요한 인간과의 높은 유사성으로 인해 원하는 특성을 가진 조절 요소를 식별하기 위한 보다 임상적으로 관련 있는 플랫폼을 제공합니다.

in vivo 스크리닝의 경우 tail vein injection, facial vein injection (neonatal mice 및 rats의 경우), intracerebroventricular injection, intrathecal injection, subretinal injection, intravitreal injection, intratympanic injection, intramuscular injection 등을 포함한 다양한 투여 경로를 사용할 수 있습니다.

Enhancer/promoter library를 타겟 세포 또는 동물에 전달한 후, 리포터 유전자 또는 바코드의 발현을 측정하여 후보 조절 요소 변이체의 활성을 평가할 수 있습니다. 원하는 특성을 가진 조절 요소를 확인하기 위해 활성이 향상된 변이체는 여러 차례의 스크리닝을 추가로 진행할 수 있습니다. Figure 3은 cone-specific promoter AAV library를 구성하고 in vivo 스크리닝을 위한 주요 단계를 보여줍니다.

Figure 3. Cone-specific promoter AAV library 제작 및 스크리닝. (A) 실험 워크플로우. 새로운 변종은 알려진 광수용체 특이적 프로모터로부터 DNA 셔플링을 통해 생성되었습니다. 그런 다음 새로운 변종을 AAV 백본에 클로닝하여 GFP 리포터의 발현을 유도했습니다. AAV 프로모터 라이브러리를 마우스의 망막하 영역에 주입하였다. Cone-specific promoter에 대한 스크리닝에는 형광 이미징, 세포 분류 및 NGS 시퀀싱이 포함되었습니다. (B)라이브러리의 망막하 발현 패턴. GFP를 구동하는 AAV 프로모터 라이브러리는 TdTomato를 구동하는 ProA1 프로모터를 운반하는 다른 AAV와 함께 주입되었습니다. ProA1은 알려진 Cone-specific promoter입니다. 빨간색과 녹색 형광의 공동 위치화는 프로모터 라이브러리에 Cone-specific promoter가 존재함을 나타냅니다.