수포성구내염바이러스 (Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Packaging)

재조합 수포성구내염바이러스 (Vesicular Stomatitis virus, VSV) 벡터는 호스트 세포로의 바이러스 진입 메커니즘 연구, 세포 진입을 위해 바이러스가 사용하는 세포 receptor 식별, 바이러스 진입 저해제 스크리닝 및 백신 개발 연구를 포함한 다양한 응용 분야에 널리 사용됩니다. VSV 벡터는 높은 수준의 봉쇄가 필요한 바이러스의 envelope 단백질과 같은 이종 바이러스에서 파생된 envelope glycoprotein을 사용하여 효율적인 pseudotype을 만들 수 있기 때문에, 이러한 고위험 바이러스의 세포 진입 메커니즘을 연구하는데 매우 적합합니다.

VectorBuilder는 특별히 벡터 클로닝 서비스에서 사용되는 VSV 벡터 시스템을 위해 titer, 순도, 생존력 및 일관성 측면에서 재조합 VSV 생산 프로토콜을 크게 개선한 자체의 기술과 시약을 개발해왔습니다.

제공되는 VSV 유형
  • VSV G 단백질로 pseudotype된 VSV
  • Coronavirus S 단백질 및 변이 단백질들로 pseudotype된 VSV
  • 요청에 따른 다른 envelope 단백질들로 pseudotype된 VSV
  • 바이러스 envelope 단백질이 없는 bald VSV (negative control로 이용될 수 있음)

서비스 세부 사항

가격 및 소요 시가
Scale Application Titer Volume Price (USD) Turnaround
VSV pseudotyped with VSV G
Medium Cell culture >107 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) $899 21-35 days
Large >108 PFU/ml $1,299
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >108 PFU/ml 500 ul (5x100 ul) $1,599
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,599
VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 S protein and its variants (Luc or EGFP as transgene)
Medium Cell culture >106 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,799 14-28 days
Large >107 PFU/ml $2,599
VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 S protein and its variants (other transgenes)
Medium Cell culture >106 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,799 21-35 days
Large >107 PFU/ml $2,599

PFU = Plaque forming units

결과물
For non-ultra-purified scales For ultra-purified scales
Your custom VSV Your custom VSV

Free: control virus

  • Medium: >10 PFU/ml, 2x100 ul
  • Large: >108 PFU/ml, 2x100 ul

  Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus

  • Ultra-purified medium: >108 PFU/ml, 5x100 ul, at $600
  • Ultra-purified large: >108 PFU/ml, 10x100 ul, at $900
Control 바이러스

Control VSV 벡터는 맞춤형 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, VSV transduction을 테스트하는데 사용됩니다. 예를 들어 맞춤형 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control 바이러스는 EGFP control VSV (EGFP 과발현 VSV) 입니다. Control 바이러스에 대한 자세한 정보는 다음과 같습니다.

벡터 시스템 Control 바이러스 벡터 이름 Control 바이러스 벡터 이름
VSV 유전자 발현 시스템 pVSV[Exp]-EGFP VB900106-5583aaf
배송 및 보관

VSV는 HBSS buffer에 용해 후 얼려서 드라이아이스와 함께 배송됩니다. 수령 즉시 장기보관을 위해 (최소 6개월 이상 안정) -80℃에서 보관해야 하며, 일주일 이내에 사용시에는 -20℃에 보관하여야 합니다. VSV의 유통기한은 약 1년입니다. VSV의 반복적인 동결-융해는 심각한 titer 감소를 초래할 수 있기 때문에 피하여야 합니다.

기술적인 정보

VSV 생산 및 QC

VSV 패키징을 위해서 glycoprotein G 유전자가 제거되고 목적 유전자 (GOI)를 가진 VSV-delta G plasmid와 VSV N, P, G 및 L 단백질을 발현하는 4개의 helper plasmid들을, bacteriophage T7 RNA polymerase를 발현하는 재조합 vaccinia virus에 감염된 세포에 transfection합니다 (Figure 1). 이 세포들로부터 채취한 상청액을 VSV G 단백질을 발현하는 plasmid로 transfection한 세포에 처리하여 G-complemented VSV stock을 생성하고 증폭합니다. 그 다음에 이종 바이러스의 envelope 단백질을 발현하는 plasmid로 일시적으로 transfection한 세포를 G-complemented VSV로 감염시킴으로써 pseudotype된 VSV를 생성합니다. Ultracentrifuge를 사용하여 VSV를 정제하는 경우 (in vivo grade), 바이러스 입자를 sucrose cushion ultracentrifugation으로 더욱 정제하고 농축합니다. 당사는 Plaque assay에 의하여 VSV titer를 측정합니다.

Figure 1. VSV 패키징의 전형적인 워크플로우.

VectorBuilder에서 생산되는 각 재조합 VSV에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있습니다. VSV-delta G 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행합니다. VSV-delta G 벡터가 항생제 선별 marker를 인코딩하면, transduction 테스트를 수행한 다음 해당 항생제 선별을 수행합니다. 추가로 ultracentrifuge에 의해 정제된 VSV의 경우, 일반적으로 endotoxin 수준를 체크하기 위해서 endotoxin 분석을 수행합니다.

실험적인 검증

VectorBuilder는 VSV 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 자체적인 기술을 개발했으며, 그 결과 당사에서 최적화된 바이러스는 기존에 알려진 다른 방법들에 비해 훨씬 높은 transduction 효율을 나타내는 것으로 확인되었습니다 (Figure 2).

Before transduction After transduction

Figure 2. VSV G 단백질로 pseudotype된 VSV를 사용하여 BHK-21 세포에 transduction하였습니다. 이미지는 transduction 하기 전과 24시간 후의 결과입니다. 배율: 100x. 왼쪽: bright field. 오른쪽: GFP.

또한, SARS-CoV-2 S 단백질 및 D614G 변이 단백질을 사용하여 VSV pseudotyping 방법에 대한 광범위한 실험적 검증을 수행하였습니다. 형광 리포터로 확인한 결과, SARS-CoV-2 S 단백질 및 D614G 변이 단백질로 pseudotype된 VSV는 높은 수준의 human ACE2 receptor를 발현하는 BHK-21 세포를 효율적으로 transduction할 수 있지만, ACE2 발현이 없거나 낮은 BHK-21 세포는 transduction이 안되는 것을 볼 수 있었습니다 (Figure 3). 따라서 이와 관련된 연구를 위해서는 SARS-CoV-2 S 단백질이나 VSV G 단백질로 pseudotype된 바이러스 transduction에 최적화된 당사의 ACE2-expressing cell line을 사용하시기를 추천합니다.

S-pseudotyped VSV D614G S-pseudotyped VSV

BHK-21 cell line BHK-21-ACE2 cell line

Figure 3. SARS-CoV-2 S 단백질과 D614G 변이 단백질에 의해 pseudotype된 VSV가 높은 수준의 human ACE2 receptor를 발현하는 BHK-21 cells에만 특이적으로 transduction되는 것을 보여주고 있습니다. 이미지는 transduction 24시간 후의 결과입니다. 배율: 100x.

주문 방법

벡터 제작과 바이러스 패키징을 함께 주문하는 경우
고객의 벡터를 사용하여 바이러스 패키징을 주문하는 경우

Customer-supplied vectors

고객이 제공하는 VSV plasmid를 사용하여 패키징하는 경우 시료 제출 가이드라인 에 따라서 벡터를 보내주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며 각 품목에 대해 $100의 추가 요금이 부과될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다.

자주 묻는 질문

VectorBuilder에서는 VSV titer를 어떻게 결정합니까?

당사에서는 plaque assay를 이용하여 VSV titer를 결정합니다. 대략, 바이러스에 감염될 수 있는 세포를 monolayer로 배양한 후에 낮은 농도로 희석된 바이러스를 처리하여 소수의 세포만 감염이 되도록 합니다. 그리고 바이러스의 전파를 제한하기 위하여 agarose로 overlay를 만듭니다. 각각의 감염이 된 세포는 용해되어 차례로 인접한 세포들을 감염시킵니다. 그 결과로 감염된 세포들이 plaque을 형성하게 됩니다. 각각의 plaque은 각각의 바이러스 입자를 대표하므로, 여러 단계로 희석된 바이러스로 처리하여 나타난 plaque의 수를 통하여 바이러스 stock의 titer를 결정할 수 있습니다.

VSV 벡터를 사용하기 위해서는 어떤 수준의 biosafety 수준이 필요합니까?

VectorBuilder에서 제조된 재조합 VSV 벡터는 envelope glycoprotein G 유전자가 제거되어 복제가 되지 않습니다. 높은 수준의 봉쇄가 필요한 바이러스를 포함하는 이종 바이러스의 envelope 단백질이 별개로 제공되어야만 VSV pseudotype을 생성할 수가 있습니다. VSV pseudotype은 한 단계 이상은 복제가 일어나지 않기 때문에, 일반적인 BSL2 수준의 시설에서 안전하게 사용될 수 있습니다. 이러한 특성으로 인하여 VSV 벡터는 높은 수준의 봉쇄 (containment) 시설 없이 고위험 바이러스의 세포 진입 메커니즘을 연구하는데 매우 적합합니다.

VectorBuilder에서는 소요 시간을 어떻게 보장합니까?

예상 소요 시간은 제조 시작부터 완료까지의 시간을 의미합니다. 고객이 제공한 시료 (template DNA나 바이러스 벡터 등)의 운송 시간과 QC, 최종 결과물을 고객에게 배송하기 위한 운송 시간은 포함되지 않습니다.