Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Packaging

재조합 Vesicular Stomatitis virus (VSV) 벡터는 호스트 세포로의 바이러스 진입 메커니즘 연구, 세포 진입을 위해 바이러스가 사용하는 세포 receptor 식별, 바이러스 진입 저해제 스크리닝 및 백신 개발 연구를 포함한 다양한 응용 분야에 널리 사용된다. VSV 벡터는 높은 수준의 방지가 필요한 바이러스의 envelope 단백질과 같은 이종 바이러스에서 파생된 envelope glycoprotein으로 효율적으로 pseudotyped될 수 있으므로, 이러한 고위험 바이러스의 진입 메커니즘을 연구하는데 매우 적합하다.

VectorBuilder는 특히 벡터 클로닝 서비스에 사용되는 VSV 벡터 시스템의 titer, 순도, 생존력 및 일관성 측면에서 재조합 VSV 생산 프로토콜을 크게 개선한 독점 기술 및 시약을 개발했다.

Types of VSV offered
  • VSV pseudotyped with VSV G protein
  • VSV pseudotyped with coronavirus S protein and its variants
  • VSV pseudotyped with any other envelope proteins as requested
  • Bald VSV lacking viral envelope protein (can be used as negative control)

Service Details

Price and turnaround
Scale Application Titer Volume Price (USD) Turnaround
VSV pseudotyped with VSV G
Medium Cell culture >108 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) $899 28-35 days
Large >109 PFU/ml $1,299
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >108 PFU/ml $1,599
Ultra-purified large >109 PFU/ml $3,599 35-42 days
VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 S protein and its variants (Luc or EGFP as transgene)
Medium Cell culture >106 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,799 28-35 days
Large >107 PFU/ml $2,599
VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 S protein and its variants (other transgenes)
Medium Cell culture >106 PFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,799 42-56 days
Large >107 PFU/ml $2,599

PFU = Plaque forming units

Deliverables
For non-ultra-purified scales For ultra-purified scales
Your custom VSV Your custom VSV

Free: control virus

  • Medium: >108 PFU/ml, 2x100 ul
  • Large: >108 PFU/ml, 2x100 ul

  Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus

  • Ultra-purified medium: >108 PFU/ml, 10x50 ul, at $600
  • Ultra-purified large: >109 PFU/ml, 10x100 ul, at $1200
Control virus

Control VSV는 커스텀 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되었으며, VSV transduction 테스트에 사용된다. 예를 들어, 커스텀 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우 제공되는 control 바이러스는 EGFP control VSV (VSV overexpressing EGFP)이다. Control 바이러스에 대한 자세한 정보는 다음과 같다.

Vector System Control Virus Vector Name Control Virus Vector ID
VSV gene expression system pVSV[Exp]-EGFP VB010000-9315gcp
Shipping and storage

VSV는 HBSS buffer에 저장되며 드라이아이스로 배송된다. 수령 즉시 -80°C에서 장기간 보관(적어도 6 개월 동안 안정)하거나, -20°C에 보관시에는 1주일 이내에 사용해야 한다. VSV의 유효 기간은 약 1 년이다. VSV의 반복된 동결-해동은 titer 저하를 초래할 수 있으므로 피해야 한다.

Technical Information

VSV production and QC

VSV 패키징 (Figure 1)의 경우, glycoprotein G 유전자가 없고 목적 유전자 (GOI)를 운반하는 VSV-delta G 플라스미드는 VSV N, P, G 및 L 단백질을 발현하는 4개의 helper 플라스미드와 함께 bacteriophage T7 RNA polymerase를 발현하는 재조합 vaccinia virus에 감염된 세포에 transfection된다. 이러한 세포로부터 채취한 상청액은 VSV G 단백질을 발현하는 플라스미드로 transfection된 세포의 새로운 디쉬에 적용되어 G-complemented VSV 스톡을 생성하고 증폭한다. VSV pseudotype은 이종 바이러스 envelop 단백질을 발현하는 플라스미드로 일시적으로 transfection한 세포를 G-complemented VSV로 감염시킴으로써 생성된다. Ultra-purified VSV (in vivo grade)의 경우 바이러스 입자는 sucrose density gradient centrifugation에 의해 추가로 정제되고 농축된다. Plaque assay를 사용하여 VSV titer를 측정한다.

Figure 1. Typical workflow of VSV packaging.

VectorBuilder에서 생산된 각 재조합 VSV에 대해 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 곰팡이에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출이 포함된다 VSV-delta G vector가 형광 단백질을 인코딩하는 경우 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행한다. VSV-delta G vector가 약물 선택 마커를 인코딩하는 경우, transduction 테스트를 수행한 다음 해당 약물 선택을 수행한다. 또한 ultra-purified VSV의 경우 endotoxin level을 확인하기 위해 일상적으로 endotoxin assay를 수행한다.

Experimental validation

VSV 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 독점 기술을 개발했다. 그 결과 최적화된 바이러스는 기존 프로토콜에 비해 훨씬 더 높은 transduction 효율을 나타낸다 (Figure 2).

Before transduction After transduction

Figure 2. VSV pseudotyped with VSV G protein was used for transducing BHK-21 cells. Images were taken before transduction and at 24 hours post-transduction. Magnification: 100x. Left: bright field. Right: GFP.

또한, SARS-CoV-2 S protein 및 D614G 돌연변이를 사용하여 VSV pseudotyping 프로토콜에 대한 광범위한 실험적 검증을 수행했다. 형광 리포터로 확인한 결과(Figure 3), SARS-CoV-2 S protein 및 D614G 돌연변이 pseudotyped VSV는 높은 수준의 human ACE2 receptor를 발현하는 BHK-21 세포를 효율적으로 transduction할 수 있지만, ACE2 발현이 없거나 낮은 BHK-21 세포는 transduction이 안된다. 따라서 SARS-CoV-2 S protein 또는 VSV G pseudotyped 바이러스로 transduction에 최적화된 ACE2-expressing cell lines을 사용하는 것을 추천한다.

S-pseudotyped VSV D614G S-pseudotyped VSV

BHK-21 cell line BHK-21-ACE2 cell line

Figure 3. VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 S protein and its D614G mutant specifically infected BHK-21 cells overexpressing human ACE2 receptor. Images were taken at 24 hours post-transduction. Magnification: 100x.

How to Order

Order both vector cloning and virus packaging
Order virus packaging of your own vector

Customer-supplied vectors

If customer-supplied VSV plasmids are used in packaging, please send them to us following the Materials Submission Guidelines. Please strictly follow our guidelines to set up shipment to avoid any delay or damage of the materials. All customer-supplied materials undergo mandatory QC by VectorBuilder which may incur $100 surcharge for each item. Please note that production may not be initiated until customer-supplied materials pass QC.

FAQ

How is VSV titer determined at VectorBuilder?

We use plaque assay for measuring VSV titer. Briefly, a monolayer of viral permissive cells is infected at a low dilution so that only a few cells get infected and overlayed with agarose to limit the spread of virus. Each infected cell lyses and infects the adjacent cells in turn, ultimately forming a group of infected cells known as a plaque. Since each plaque represents a single virus, the titer of a viral stock can be determined by counting the number of plaques obtained from varying dilutions of that stock.

Which biosafety level is required for VSV vectors?

Recombinant VSV vectors generated by VectorBuilder are deficient in replication due to deletion of the envelop glycoprotein G gene. The envelop proteins of heterologous viruses, including viruses requiring high-level containment can be supplied in trans for producing VSV pseudotypes. Since VSV pseudotypes are unable to undergo more than a single round of replication, they can be safely handled in a regular BSL2 facility. This makes VSV vectors highly suitable for studying cell entry mechanisms of high-risk viruses without the requirement of high-level containment.

What is VectorBuilder’s guarantee for turnaround?

The estimated turnaround is the time from production initiation to completion. It does not include waiting time for any customer-supplied materials (e.g. template DNA or viral vectors), QC of such materials, and transit time for shipping final deliverables to the customer.