아데노바이러스 (Adenovirus Packaging)
재조합 아데노바이러스 벡터는 다양한 포유류 세포 유형에서 높은 수준의 transgene 발현을 위해 사용되는데, 이 때 벡터는 호스트 유전체에 결합되지 않고 episomal DNA로 남아 있게 됩니다. 높은 transduction 효율과 높은 수준의 단기 유전자 발현으로 인하여 아데노바이러스 벡터는 in vivo 유전자 전달을 위하여 선호되는 툴로 유전자 치료와 백신에 자주 사용됩니다.
VectorBuilder는 특별히 벡터 클로닝 서비스에서 사용되는 아데노바이러스 벡터 시스템을 위해 titer, 순도, 효능 및 일관성 측면에서 재조합 아데노바이러스 생산 프로토콜을 크게 개선한 자체의 기술과 시약을 개발해 왔습니다. 그 결과 고객의 아데노바이러스 벡터 클로닝과 아데노바이러스 패키징에 대한 요구를 만족시킴으로써 당사에 반복적으로 의뢰하는 고객들이 점점 많아지고 있습니다.
제공되는 아데노바이러스 유형
- Conventional human Ad5 adenovirus
- Conventional chimeric Ad5/F35 adenovirus
- Gutless human Ad5 adenovirus
- Gutless chimeric Ad5/F35 adenovirus
- Other adenovirus serotypes, such as Ad2
서비스 세부 사항
Human Ad5 adenovirus
Chimeric Ad5/F35 adenovirus
Gutless Ad5 adenovirus
Gutless Ad5/F35 adenovirus
가격 및 소요 시간 Price Match
| Scale | Application | Typical Titer | Minimum Titer | Volume | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Pilot | Cell culture | >2x1010 IFU/ml | >1010 IFU/ml | 250 ul (10x25 ul) | $649 | 28-35 days |
| Medium | 1 ml (10x100 ul) | $1,099 | ||||
| Large | >2x1011 IFU/ml | >1011 IFU/ml | 1 ml (10x100 ul) | $1,699 | ||
| Ultra-purified medium | Cell culture & in vivo | >2x1012 VP/ml | >1012 VP/ml | 500 ul (10x50 ul) | $2,099 | |
| Ultra-purified large | 1 ml (10x100 ul) | $2,499 |
IFU = Infectious units; VP = Virus particles
Deliverables
| For Non-Ultra-Purified Scales | For Ultra-Purified Scales |
|---|---|
| Your custom Ad5 adenovirus | Your custom Ad5 adenovirus |
|
Free: control virus
|
Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus
|
Control 바이러스
Control 아데노바이러스 벡터는 맞춤형 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, 아데노바이러스 transduction을 테스트하는데 사용됩니다. 예를 들어 맞춤형 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control 바이러스는 EGFP control 아데노바이러스 (EGFP 과발현 아데노바이러스)이고, 맞춤형 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공되는 control 바이러스는 scramble shRNA를 발현합니다. Control 바이러스에 대한 자세한 정보는 다음과 같습니다.
| Vector System | Control Virus Vector Name | Control Virus Vector ID |
|---|---|---|
| Adenovirus gene expression system | pAV[Exp]-CMV>EGFP | VB010000-9299hac |
| Adenovirus U6-based shRNA knockdown system | pAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA | VB010000-0020ytx |
| Adenovirus miR30-based shRNA knockdown system | pAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA | VB010000-9350dnk |
| Adenovirus CRISPR system | pAV[Exp]-CMV>EGFP | VB010000-9299hac |
배송 및 보관
Ultracentrifuge로 정제하지 않은 아데노바이러스는 HBSS buffer에 저장되고, Ultracentrifuge로 정제한 아데노바이러스는 GTS buffer에 저장됩니다. 당사의 아데노바이러스는 얼려서 드라이아이스와 함께 배송됩니다. 수령 즉시 장기보관을 위해 (최소 1년 이상 안정) -80℃에서 보관해야 하며, 2-3주 정도의 단기간내 사용시에는 -20℃에 보관하여야 합니다. 아데노바이러스는 다른 여러 바이러스들 (예: 렌티바이러스)보다 안정하며 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해는 피하는 것이 좋습니다.
가격 및 소요 시간 Price Match
| Scale | Application | Typical Titer | Minimum Titer | Volume | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Pilot | Cell culture | >2x1010 IFU/ml | >1010 IFU/ml | 250 ul (10x25 ul) | $1,099 | 35-42 days |
| Medium | 1 ml (10x100 ul) | $1,699 | ||||
| Large | >2x1011 IFU/ml | >1011 IFU/ml | 1 ml (10x100 ul) | $2,599 | ||
| Ultra-purified medium | Cell culture & in vivo | >2x1012 VP/ml | >1012 VP/ml | 500 ul (10x50 ul) | $3,199 | |
| Ultra-purified large | 1 ml (10x100 ul) | $3,799 |
IFU = Infectious units; VP = Virus particles
Deliverables
| For Non-Ultra-Purified Scales | For Ultra-Purified Scales |
|---|---|
| Your custom chimeric Ad5/F35 adenovirus | Your custom chimeric Ad5/F35 adenovirus |
|
Free: control virus
|
Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus
|
Control 바이러스
Control Ad5/F35 아데노바이러스 벡터는 맞춤형 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, Ad5/F35 아데노바이러스 transduction을 테스트하는데 사용됩니다. 예를 들어 맞춤형 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control 바이러스는 EGFP control Ad5/F35 아데노바이러스 (EGFP 과발현 Ad5/F35 아데노바이러스)이고, 맞춤형 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공되는 control 바이러스는 scramble shRNA를 발현합니다. Control 바이러스에 대한 자세한 정보는 다음과 같습니다.
| Vector System | Control Virus Vector Name | Control Virus Vector ID |
|---|---|---|
| Ad5/F35 adenovirus gene expression system | pAd5/F35[Exp ]-CMV>EGFP | VB010000-9301bcw |
배송 및 보관
Ultracentrifuge로 정제하지 않은 아데노바이러스는 HBSS buffer에 저장되고, Ultracentrifuge로 정제한 아데노바이러스는 GTS buffer에 저장됩니다. 당사의 아데노바이러스는 얼려서 드라이아이스와 함께 배송됩니다. 수령 즉시 장기보관을 위해 (최소 1년 이상 안정) -80℃에서 보관해야 하며, 2-3주 정도의 단기간내 사용시에는 -20℃에 보관하여야 합니다. 아데노바이러스는 다른 여러 바이러스들 (예: 렌티바이러스)보다 안정하며 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해는 피하는 것이 좋습니다.
가격 및 소요 시간 Price Match
| Scale | Application | Minimum Titer | Volume | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|---|---|
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >1011 VP/ml | 250 ul (5x50 ul) | $2,599 | 35-42 days |
| Ultra-purified medium | Cell culture & in vivo | >1011 VP/ml | 500 ul (10x50 ul) | $3,999 | |
| Ultra-purified large | Cell culture & in vivo | >1011 VP/ml | 1 ml (10x100 ul) | $4,999 |
VP = Virus particles
Deliverables
| Your custom gutless Ad5 adenovirus |
|
Add-on purchase (optional): ultra-purified control gutless Ad5 adenovirus
|
Control 바이러스
Control gutless 아데노바이러스 벡터는 맞춤형 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, gutless 아데노바이러스 transduction을 테스트하는데 사용됩니다. 예를 들어 맞춤형 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control 바이러스는 EGFP control gutless 아데노바이러스 (EGFP 과발현 gutless 아데노바이러스)이고, 맞춤형 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공되는 control 바이러스는 scramble shRNA를 발현합니다. Control 바이러스에 대한 자세한 정보는 다음과 같습니다.
| Vector System | Control Virus Vector Name | Control Virus Vector ID |
|---|---|---|
| Gutless adenovirus gene expression system | pGLAd[Exp ]-CMV>EGFP | VB010000-9400ggg |
배송 및 보관
Ultracentrifuge로 정제한 아데노바이러스는 GTS buffer에 저장됩니다. 아데노바이러스는 드라이아이스와 함께 배송됩니다. 수령 즉시 장기보관을 위해 (최소 1년 이상 안정) -80℃에서 보관해야 하며, 2-3주 정도의 단기간내 사용시에는 -20℃에 보관하여야 합니다. 아데노바이러스는 다른 여러 바이러스들 (예: 렌티바이러스)보다 안정하며 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해는 피하는 것이 좋습니다.
가격 및 소요 시간 Price Match
| Scale | Application | Minimum Titer | Volume | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|---|---|
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >1011 VP/ml | 250 ul (5x50 ul) | $2,599 | 35-42 days |
| Ultra-purified medium | Cell culture & in vivo | >1011 VP/ml | 500 ul (10x50 ul) | $3,999 | |
| Ultra-purified large | Cell culture & in vivo | >1011 VP/ml | 1 ml (10x100 ul) | $4,999 |
VP = Virus particles
Deliverables
| Your custom gutless Ad5/F35 adenovirus |
|
Add-on purchase (optional): ultra-purified control gutless Ad5/F35 adenovirus
|
Control 바이러스
Control gutless Ad5/F35 아데노바이러스는 맞춤형 바이러스의 생물학적 응용과 일치하고 gutless 아데노바이러스 transduction을 테스트하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 맞춤형 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공된 control 바이러스는 EGFP를 과발현하는 control gutless Ad5/F35 아데노바이러스가 됩니다. Control 바이러스에 대한 자세한 정보는 아래와 같습니다.
| Vector System | Control Virus Vector Name | Control Virus Vector ID |
|---|---|---|
| Gutless adenovirus gene expression system | pGLAd[Exp ]-CMV>EGFP | VB010000-9400ggg |
배송 및 보관
Ultra-purifed 아데노바이러스는 GTS buffer에 저장되어 드라이아이스와 함께 배송됩니다. 아데노바이러스는 수령 후 -80°C(최소 1년 동안 안정함) 또는 -20°C(2~3주 동안 안정함)에서 보관해야 합니다. 아데노바이러스는 다른 많은 바이러스(예: 렌티바이러스)보다 안정적이고 여러 번 동결과 융해에도 바이러스 활성 손실은 적지만 실제로는 반복적인 동결-융해는 피하는 것이 좋습니다.
기술적인 정보
Human Ad5 adenovirus
Chimeric Ad5/F35 adenovirus
Gutless Ad5 adenovirus
Gutless Ad5/F35 adenovirus
Adenovirus 생산 및 품질관리 (QC)
재조합 아데노바이러스 제조를 위해서 목적 유전자(GOI)를 가진 아데노바이러스 벡터는 제한효소 PacI으로 선형화됩니다. 선형화된 벡터 DNA는 아데노바이러스 유전자 E1을 발현하는 패키징 세포에 transfection되어 재조합 아데노바이러스 생성하며, 아데노바이러스 입자는 배양배지로 배출되어 채집됩니다. Ultra-purified 아데노바이러스 (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자가 더욱 정제되고 농축됩니다. VectorBuilder는 아데노바이러스의 hexon 단백질을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정합니다. Ultra-purified 아데노바이러스 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260) 를 측정하여 titer를 추정합니다.
Figure 1. Typical workflow of Ad5 adenovirus packaging.
VectorBuilder에서 생산되는 각각의 아데노바이러스에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있습니다. 아데노바이러스 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행합니다. 추가로 ultracentrifuge에 의해 정제된 아데노바이러스의 경우, endotoxin 분석을 통하여 virus 품질을 체크합니다.
실험 목적에 가장 적합한 아데노바이러스 유형을 결정하는데 도움이 필요하면 FAQ를 참조하세요.
Chimeric Ad5/F35 adenovirus 생산 및 품질관리 (QC)
Chimeric Ad5/F35 아데노바이러스 제조를 위해서 목적 유전자(GOI)를 가진 Ad5/F35 아데노바이러스 벡터는 제한효소 PacI으로 선형화됩니다 (Figure 2). 선형화된 벡터 DNA는 아데노바이러스 유전자 E1을 발현하는 패키징 세포에 transfection되어 재조합 아데노바이러스 생성하며, 아데노바이러스 입자는 배양배지로 배출되어 채집됩니다. Ultra-purified 아데노바이러스 (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자가 더욱 정제되고 농축됩니다. VectorBuilder는 아데노바이러스의 hexon 단백질을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정합니다. Ultra-purified 아데노바이러스 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260) 를 측정하여 titer를 추정합니다.
Figure 2. Typical workflow of chimeric Ad5/F35 adenovirus packaging.
VectorBuilder에서 생산되는 각각의 아데노바이러스에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있습니다. 아데노바이러스 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행합니다. 추가로 ultracentrifuge에 의해 정제된 아데노바이러스의 경우, endotoxin 분석을 통하여 virus 품질을 체크합니다.
Ad5 아데노바이러스 vs. chimeric Ad5/F35 아데노바이러스
Human 아데노바이러스 serotype 5 (Ad5) 벡터는 아데노바이러스에 기반한 벡터로 가장 널리 사용되지만, 이 벡터들의 주된 한계는 표적 세포를 감염시키기 위해서는 coxsackie and adenovirus receptor (CAR)에 의존한다는 점입니다. CAR의 발현이 완전히 결여되거나 불충분한 호스트 세포는 Ad5 벡터에 의한 효율적인 transduction이 될 수 없습니다. Ad5/F35 벡터는 아데노바이러스 serotype 35 (Ad35)에서 파생된 knob 및 shaft와 Ad5에서 유래한 fiber tail로 구성된 chimeric fiber 단백질을 발현함으로써 이러한 한계점을 극복할 수 있도록 디자인 되었습니다. Ad35 fiber 단백질이 CAR receptor가 아닌 CD46을 통해 타겟 세포에 부착되는 능력을 이용하여, Ad5/F35 아데노바이러스 벡터는 CAR 발현 수치가 높은 CAR-positive 세포 외에 CAR 발현이 안되거나 낮은 세포에도 쉽게 transduction할 수 있습니다. Ad5/F35 아데노바이러스 키메라 디자인은 아데노바이러스 벡터의 tropism을 hematopoietic cell, primitive stem cell, vascular smooth muscle cell 및 CAR-negative tumor cell과 같이 기존의 Ad5 벡터에 의하여 transduction이 잘 되지 않던 세포들로 확장하는 데 매우 중요한 방편이 되었습니다.
실험 목적에 가장 적합한 아데노바이러스 유형을 결정하는데 도움이 필요하면 FAQ를 참조하세요.
Gutless 아데노바이러스 생산 및 QC
Gutless 아데노바이러스 제조를 위해서는 promoter와 목적 유전자(GOI)를 포함하는 발현 카세트를 gutless 아데노바이러스 벡터의 두 inverted terminal repeats (ITRs) 사이에 클로닝합니다 (Figure 1). 또한, 벡터는 두 ITR 사이에 virion의 효율적인 패키징을 위하여 필요한 28kb 이상의 최종 사이즈를 유지하기 위해 적절한 길이의 stuffer 서열을 포함합니다. 양쪽의 ITR과 발현카세트를 포함하는 벡터 영역은 제한효소 절단에 의해 plasmid에서 분리됩니다. 분리된 단편은 패키징 세포로 transfection되고 이어서 재조합 아데노바이러스 입자를 생성하기 위해 helper 바이러스로 infection됩니다. Gutless 아데노바이러스 벡터 시스템은 패키징 signal 양쪽으로 두개의 loxP site가 있는 helper 바이러스와 함께 Cre recombinase를 안정적으로 발현하는 패키징 세포주를 사용함으로써, Cre에 의하여 helper 바이러스의 패키징 signal이 절단되게 합니다. 이를 통하여 helper 바이러스 유전체가 gutless 아데노바이러스 유전체와 함께 바이러스 입자로 패키징되는 것을 방지합니다. 아데노바이러스 입자는 배양배지로 배출되어 채집됩니다.
Ultra-purified 아데노바이러스 (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자가 더욱 정제되고 농축됩니다. 당사는 아데노바이러스의 hexon 단백질을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정합니다. Ultra-purified 아데노바이러스 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260) 를 측정하여 titer를 추정합니다.
Figure 3. Typical workflow of gutless Ad5 adenovirus packaging.
VectorBuilder에서 생산되는 각각의 아데노바이러스에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있습니다. 아데노바이러스 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행합니다. 추가로 ultracentrifuge에 의해 정제된 아데노바이러스의 경우, endotoxin 분석을 통하여 virus 품질을 체크합니다.
Ad5 아데노바이러스와 Ad5/F35 아데노바이러스에 대한 gutless 아데노바이러스의 장점들
Gutless 아데노바이러스 벡터(a.k.a. helper-dependent 아데노바이러스 벡터)는 기존의 Ad5 또는 chimeric Ad5/F35 아데노바이러스 벡터들에 비해 여러 가지 장점을 제공하는 가장 최근에 개발된 아데노바이러스 벡터입니다. 바이러스 복제 및 패키징에 필수적인 cis-acting element들을 제외한 거의 모든 바이러스 서열이 제거되었기 때문에, gutless 아데노바이러스 벡터는 in vivo에서 사용될 때 면역반응을 최소화하며 장기간의 transgene 발현이 가능합니다. 따라서 Ad5 또는 Ad5/F35 아데노바이러스에 비해 안전성이 크게 향상되어, 유전자 치료 분야에서 매우 관심을 끄는 후보군이 됩니다. 더불어, 바이러스 코딩 서열이 없기 때문에 최대 33kb까지 외부 서열을 넣을 수 있어서, 매우 길거나 여러 개의 transgene을 발현해야 하는 경우에 매우 적합합니다.
실험 목적에 가장 적합한 아데노바이러스 유형을 결정하는데 도움이 필요하면 FAQ를 참조하세요.
Gutless Ad5/F35 adenovirus 생산 및 품질관리 (QC)
Gutless Ad5/F35 아데노바이러스 제조는 프로모터와 목적유전자(GOI)를 포함하는 발현 카세트를 gutless 아데노바이러스 벡터의 inverted terminal repeats (ITRs) 사이에 클로닝합니다(Figure 4). 또한, VectorBuilder의 벡터는 virions의 효율적인 패키징을 촉진하는데 필요한 두 ITR 사이에 28 kb 이상의 최종 크기를 유지하기 위해 적절한 길이의 stuffer 서열을 포함합니다. 양쪽의 ITR과 발현 카세트를 포함하는 벡터 영역은 제한효소 절단에 의해 plasmid에서 분리됩니다. 분리된 단편은 패키징 세포로 transfection되고 이어서 재조합 아데노바이러스 입자를 생성하기 위해 helper 바이러스로 infection 됩니다. Gutless 아데노바이러스 벡터 시스템은 패키징 signal 양쪽으로 두개의 loxP site가 있는 helper 바이러스와 함께 Cre recombinase를 안정적으로 발현하는 패키징 세포주를 사용함으로써, Cre에 의하여 helper 바이러스의 패키징 signal이 절단되게 합니다. 이를 통하여 helper 바이러스 유전체가 gutless 아데노바이러스 유전체와 함께 바이러스 입자로 패키징되는 것을 방지합니다. 아데노바이러스 입자는 배양배지로 배출되어 채집됩니다.
Ultra-purified 아데노바이러스 (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자가 더욱 정제되고 농축됩니다. VectorBuilder는 아데노바이러스의 hexon 단백질을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정합니다. Ultra-purified 아데노바이러스 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260)를 측정하여 titer를 측정합니다.
Figure 4. Typical workflow of gutless Ad5/F35 adenovirus packaging.
VectorBuilder에서 생산되는 각각의 아데노바이러스에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있습니다. 아데노바이러스 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우, 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행합니다. 추가로 ultra-purifided 아데노바이러스의 경우, 정기적으로 endotoxin 레벨을 체크하며 유상옵션으로 COA에 endotoxin 결과를 추가할 수 있습니다. 추가 QC 서비스는 유상옵션으로 진행할 수 있습니다.
실험 목적에 가장 적합한 아데노바이러스 유형을 결정하는데 도움이 필요하면 FAQ를 참조하세요.
Gutless Ad5 및 기존 아데노바이러스와 비교해 gutless Ad5/F35 아데노바이러스의 장점
VectorBuilder의 gutless Ad5/F35 아데노바이러스 벡터는 gutless 아데노바이러스와 Ad/F35 아데노바이러스의 장점을 결합하여 면역원성 감소, 더 긴 transgene 발현, 더 큰 운반 용량, 더 광범위한 tropism을 보여 줍니다.
Gutless 아데노바이러스 벡터(일명 helper-dependent 아데노바이러스 벡터)는 기존 아데노바이러스 벡터에 비해 여러 가지 장점을 제공하는 최신 아데노바이러스 벡터입니다. 바이러스 복제 및 패키징에 필수적인 cis-acting element를 제외한 거의 모든 바이러스 서열이 없기 때문에 gutless 아데노바이러스 벡터는 in vivo에서 사용할 때 최소한의 면역원성과 장기간 transgene 발현을 보입니다. 따라서 기존 Ad5 또는 Ad5/F35에 비해 안전성이 상당히 개선되어 유전자 치료 응용 분야에 매력적인 후보가 됩니다. 또한 바이러스 코딩 서열이 없기 때문에 최대 33kb의 서열을 넣을 수 있어 길거나 여러 transgene을 발현하는 경우 매우 적합합니다.
Human adenovirus serotype 5(Ad5) 벡터는 아데노바이러스 기반 응용 분야에서 가장 널리 사용되지만, 이 벡터는 표적 세포를 감염시키기 위해 coxsackie & adenovirus receptor(CAR)에 의존한다는 점이 한계가 됩니다. Ad5/F35 벡터는 아데노바이러스 serotype 35(Ad35)의 knob와 shaft를 Ad5의 fiber tail와 결합하는 chimeric fiber 단백질을 통합하여 이러한 한계를 극복합니다. 이 설계로 Ad5/F35 벡터는 Ad35 fiber 단백질이 non-CAR receptor인 CD46을 통해 표적 세포에 부착하는 능력을 이용하여, CAR-positive 세포 뿐만 아니라 CAR-negative 세포, 또는 CAR 발현이 낮은 세포에도 효율적으로 transduction 할 수 있습니다. Ad5/F35 아데노바이러스 키메라 디자인은 아데노바이러스 벡터의 tropism을 hematopoietic cell, primitive stem cell, vascular smooth muscle cell 및 CAR-negative tumor cell과 같이 기존의 Ad5 벡터에 의하여 transduction이 잘 되지 않던 세포들로 확장하는 데 매우 중요한 방편이 되었습니다.
실험에 의한 검증
Human Ad5 adenovirus
Chimeric Ad5/F35 adenovirus
Gutless Ad5 adenovirus
Gutless Ad5/F35 adenovirus
Figure 5. HEK293A cells were transduced with EGFP-expressing Ad5 adenovirus at an MOI of 10. Magnification: 100x. Left: bright field. Right: GFP.
VectorBuilder는 Ad5/F35 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 독자 기술을 개발했습니다. VectorBuilder의 최적화된 Ad5/F35 아데노바이러스는 기존 Ad5 아데노바이러스에 비해 CAR 발현이 부족한 세포에서 훨씬 더 높은 transduction 효율을 보이는 것으로 검증되었습니다(Figure 6).
Figure 6. K562 cells were transduced with EGFP-expressing Ad5 or Ad5/F35 adenovirus at increasing MOI, and EGFP positive cells were analyzed by flow cytometry at 48 hours post-transduction. K562 cells exhibit low levels of CAR expression as shown by previous studies.
Gutless Ad5 아데노바이러스 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 자체적인 기술을 개발했습니다. VectorBuilder의 최적화된 gutless 아데노바이러스는 포유류 세포주에서 높은 transduction 효율을 나타내는 것으로 확인되었습니다.
Figure 7. HEK293A 세포를 EGFP를 발현하는 gutless Ad5 아데노바이러스로 MOI 1000에서 transduction 하였습니다. 배율: 100x. Left: bright field. Right: GFP.
Gutless Ad5/F35 아데노바이러스 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 독자 기술을 개발했습니다. VectorBuilder의 최적화된 gutless chimeric 아데노바이러스는 포유류 세포주에서 높은 transduction 효율을 나타내는 것으로 확인되었습니다.
Figure 8. HEK293A 세포를 EGFP를 발현하는 gutless Ad5/F35 아데노바이러스로 MOI 1000에서 transduction하였습니다. 배율: 100x. Left: bright field. Right: GFP.
주문 방법
고객이 제공하는 벡터
고객이 제공하는 AAV 벡터를 사용하여 패키징하는 경우 시료 제출 가이드라인에 따라서 벡터를 보내주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며 각 품목에 대해 $100의 추가 요금이 부과될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다.
자료
자주 묻는 질문
| 렌티바이러스 | MMLV | 아데노바이러스 | AAV | |
|---|---|---|---|---|
| Tropism (친화성) | Broad | Broad | 어떤 세포들에는 비효율적임 | 바이러스 serotype (혈청형)에 따라서 다름 |
| 분열하지 않는 세포에 감염이 가능한가? | Yes | No | Yes | Yes |
| 호스트 유전체에 안정한 결합을 하는가 아니면 단기적인가? | Stable integration | Stable integration | Transient, episomal | Transient, episomal |
| 최대 titer | High | Moderate | High | Very high |
| 맞춤형 promoter | Yes | No | Yes | Yes |
| 주요 용도 | Cell culture and in vivo | Cell culture and in vivo | In vivo | In vivo |
| In vivo에서의 면역반응 | Low | Low | High | Very low |
어떤 유형의 아데노바이러스를 사용할 지에 대한 주요 고려 사항은 (1) 타겟 세포 유형과 (2) 전달될 구성요소의 길이입니다. 타겟 세포가 CAR 발현이 낮거나 전혀 없는 경우, 키메라(Ad5/F35) 아데노바이러스가 가장 효과적으로 유전자를 전달합니다. 전달될 GOI, 프로모터 및 기타 구성 요소가 8.2 kb를 초과하는 경우, gutless 아데노바이러스가 가장 좋은 선택입니다.
| Human Ad5 | Ad5/F35 | Gutless Ad5 | Gutless Ad5/F35 | |
|---|---|---|---|---|
| Vector structure | Region between ITRs lacking E1A, E1B, and E3 genes | Region between ITRs lacking E1A, E1B, and E3 genes | Region between ITRs lacks any viral sequences except cis-acting elements | Region between ITRs lacks any viral sequences except cis-acting elements |
| Capsid structure | Conventional Ad5 capsid, binds to coxsackie and adenovirus receptor (CAR) | Chimeric fiber protein comprised of knob and shaft derived from Ad35 and fiber tail from Ad5, binds to CD46 | Conventional Ad5 capsid, binds to coxsackie and adenovirus receptor (CAR) | Chimeric fiber protein comprised of knob and shaft derived from Ad35 and fiber tail from Ad5, binds to CD46 |
| Cargo capacity | 7.5 kb | 8.2 kb | 33 kb | 33 kb |
| Tropism | Broad, but requires expression of CAR | Very broad | Broad, but requires expression of CAR | Very broad |
| Immune response in vivo | High | High | Low | Low |
| Helper virus needed | No | No | Yes | Yes |
아데노바이러스에 대해서는 기능적인 titer를 측정합니다. 연속적으로 희석한 아데노바이러스를 HEK293 세포에 transduction한 후에 immunochemistry에 의하여 아데노바이러스의 hexon 단백질을 발현하는 세포를 착색하고, 착색된 세포 하나를 one infectious unit으로 계산합니다. 대부분의 각각의 세포가 하나의 바이러스 입자에 의해서만 transduction이 되도록 매우 낮은 MOI를 사용하며, 이 방법은 기존의 plaque assay와 좋은 상관관계를 보여줍니다. Ultra-purified 아데노바이러스의 경우는 optical density와 기능적인 titer가 높은 상관성을 보여주기 때문에 optical density (OD260) 를 이용하여 titer를 결정합니다. 아데노바이러스는 안정성이 매우 높으며, 기본적으로 모든 바이러스 입자가 살아있으며, 상온에서도 며칠 동안 기능을 유지할 수 있습니다.
VectorBuilder에 의하여 보장되는 titer는 패키징 되는 5’ ITR에서 3’ ITR의 영역이 아데노바이러스 cargo limit (38.7 kb) 이하일 때 적용됩니다. 그 이상의 경우 아데노바이러스 유전체가 불안정해질 수 있고, 패키징 도중에 재배열이 일어날 수도 있습니다. 또한 다음과 같은 벡터들의 경우 titer를 보장해드릴 수 없습니다.
- Proapoptotic 유전자와 같이 숙주 세포에 대한 독성을 나타낼 수 있는 유전자들, 세포막 단백질과 같이 세포들이 응집하게 만들어서 세포나 바이러스의 integrity를 손상시킬 수 있는 유전자들과 같이 패키징 과정에 유해한 작용을 할 수 있는 서열들이 포함되어 있거나, 반복 서열 또는 GC 함량이 매우 높아서 재배열이나 2차 구조를 만들 가능성이 높은 서열을 포함하는 벡터들.
- 고객이 제공한 transfer plasmid에 패키징 효율에 불확실성을 제공할 수 있는 공개되지 않은 서열이나 일반적이지 않은 ITR을 포함하는 경우.
예상 소요 시간은 제조 시작부터 완료까지의 시간을 의미합니다. 고객이 제공한 시료 (template DNA나 바이러스 벡터 등)의 운송 시간과 QC, 최종 결과물을 고객에게 배송하기 위한 운송 시간은 포함되지 않습니다.
주요 인용 논문
Prolonged breastfeeding protects from obesity by hypothalamic action of hepatic FGF21
Veronica Pena-Leon, et al.
Nature Metabolism, 2022, doi: 10.1038/s42255-022-00602-z
Products used:
- Adenovirus Packaging
- Adeno-Associated Virus (AAV) Packaging
- Vector Cloning
Abstract:Early-life determinants are thought to be a major factor in the rapid increase of obesity. However, while maternal nutrition has been extensively studied, the effects of breastfeeding by the infant on the reprogramming of energy balance in childhood and throughout adulthood remain largely unknown. Here we show that delayed weaning in rat pups protects them against diet-induced obesity in adulthood, through enhanced brown adipose tissue thermogenesis and energy expenditure. In-depth metabolic phenotyping in this rat model as well as in transgenic mice reveals that the effects of prolonged suckling are mediated by increased hepatic fibroblast growth factor 21 (FGF21) production and tanycyte-controlled access to the hypothalamus in adulthood. Specifically, FGF21 activates GABA-containing neurons expressing dopamine receptor 2 in the lateral hypothalamic area and zona incerta. Prolonged breastfeeding thus constitutes a protective mechanism against obesity by affecting long-lasting physiological changes in liver-to-hypothalamus communication and hypothalamic metabolic regulation.
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Neutrophil elastase selectively kills cancer cells and attenuates tumorigenesis
Chang Cui, et al.
Cell, 2021, doi: 10.1016/j.cell.2021.04.016
Products used:
- Adenovirus Packaging
- Vector Cloning
Abstract:Cancer cell genetic variability and similarity to host cells has stymied development of broad anti-cancer therapeutics. Our innate immune system evolved to clear genetically diverse pathogens and limit host toxicity; however, whether/how innate immunity can produce similar effects in cancer is unknown. Here, we show that human, but not murine, neutrophils release catalytically active neutrophil elastase (ELANE) to kill many cancer cell types while sparing non-cancer cells. ELANE proteolytically liberates the CD95 death domain, which interacts with histone H1 isoforms to selectively eradicate cancer cells. ELANE attenuates primary tumor growth and produces a CD8 +T cell-mediated abscopal effect to attack distant metastases. Porcine pancreatic elastase (ELANE homolog) resists tumor-derived protease inhibitors and exhibits markedly improved therapeutic efficacy. Altogether, our studies suggest that ELANE kills genetically diverse cancer cells with minimal toxicity to non-cancer cells, raising the possibility of developing it as a broad anti-cancer therapy.
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Disease modification and symptom relief in osteoarthritis using a mutated GCP-2/CXCL6 chemokine
Sara Caxaria, et al.
EMBO Molecular Medicine, 2022, doi: 10.15252/emmm.202216218
Products used:
- Adenovirus Packaging
- Vector Cloning
Abstract:We showed that the chemokine receptor C-X-C Motif Chemokine Receptor 2 (CXCR2) is essential for cartilage homeostasis. Here, we reveal that the CXCR2 ligand granulocyte chemotactic protein 2 (GCP-2) was expressed, during embryonic development, within the prospective permanent articular cartilage, but not in the epiphyseal cartilage destined to be replaced by bone. GCP-2 expression was retained in adult articular cartilage. GCP-2 loss-of-function inhibited extracellular matrix production. GCP-2 treatment promoted chondrogenesis in vitroand in human cartilage organoids implanted in nude mice in vivo. To exploit the chondrogenic activity of GCP-2, we disrupted its chemotactic activity, by mutagenizing a glycosaminoglycan binding sequence, which we hypothesized to be required for the formation of a GCP-2 haptotactic gradient on endothelia. This mutated version (GCP-2-T) had reduced capacity to induce transendothelial migration in vitroand in vivo, without affecting downstream receptor signaling through AKT, and chondrogenic activity. Intra-articular adenoviral overexpression of GCP-2-T, but not wild-type GCP-2, reduced pain and cartilage loss in instability-induced osteoarthritis in mice. We suggest that GCP-2-T may be used for disease modification in osteoarthritis.
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