Adenovirus Packaging

재조합 adenovirus 벡터는 다양한 포유류 세포 유형에서 높은 수준의 transgene 발현을 위해 사용되는데, 벡터는 호스트 게놈에 통합되지 않고 episomal DNA로 남아 있다. 높은 transduction 효율과 높은 수준의 단기 유전자 발현이 adenovirus 벡터를 in vivo 유전자 전달에 선호하는 툴로 만들어, 유전자 치료와 백신에 자주 사용된다.

VectorBuilder는 특히 벡터 클로닝 서비스에 사용되는 adenovirus 벡터 시스템을 위해 titer, 순도, 생존력 및 일관성 측면에서 재조합 adenovirus 생산 프로토콜을 크게 개선한 독점 기술과 시약을 개발했다. 그 결과 adenovirus 벡터 클로닝과 adenovirus 패키징에 대한 니즈에 만족하여 당사에 반복적으로 의뢰하는 고객들이 많아지고 있다.

Types of adenovirus offered
  • Human Ad5 adenovirus
  • Chimeric Ad5/F35 adenovirus
  • Gutless adenovirus

Service Details

Human Ad5 adenovirus
Chimeric Ad5/F35 adenovirus
Gutless adenovirus
Price and turnaround
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >2x1010 IFU/ml >1010 IFU/ml 250 ul (10x25 ul) $399 20-32 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $599
Large >2x1011 IFU/ml >1011 IFU/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x1012 VP/ml >1012 VP/ml 500 ul (10x50 ul) $1,299 22-36 days
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $1,599

IFU = Infectious units; VP = Virus particles

Deliverables
For non-ultra-purified scales For ultra-purified scales
Your custom Ad5 adenovirus Your custom Ad5 adenovirus

Free: control virus

  • Pilot: >1010 IFU/ml, 100 ul
  • Medium: >1010 IFU/ml, 2x100 ul
  • Large: >1010 IFU/ml, 2x100 ul

  Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus

  • Ultra-purified medium: >1012 VP/ml, 10x50 ul, at $440
  • Ultra-purified large: >1012 VP/ml, 10x100 ul, at $540
Control virus

Control adenovirus 벡터는 custom 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, adenovirus transduction을 테스트하는데 사용된다. 예를 들어 custom 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control virus는 EGFP control adenovirus (adenovirus overxpressing EGFP)이고, custom 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공되는 control virus는 scramble shRNA를 발현한다. Control virus에 대한 자세한 정보는 다음과 같다.

Vector System Control Virus Vector Name Control Virus Vector ID
Adenovirus gene expression system pAV[Exp]-CMV>EGFP VB010000-9299hac
Adenovirus U6-based shRNA knockdown system pAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA VB010000-0020ytx
Adenovirus miR30-based shRNA knockdown system pAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA VB010000-9350dnk
Adenovirus CRISPR system pAV[Exp]-CMV>EGFP VB010000-9299hac
Shipping and storage

Non-ultra-purified adenovirus는 HBSS buffer에 보관되며, ultra-purified adenovirus는 GTS buffer에 보관된다. 모든 adenovirus는 드라이아이스로 운송된다. Adenovirus는 수령 즉시, 장기보관을 위해서는 -80℃ (1년 이상 안정 가능) 또는 단기 보관을 위해서는 -20℃ (예: 2-3주)에서 보관하여야 한다. Adenovirus는 다른 많은 바이러스(예: Lentivirus) 보다 안정성이 뛰어나고 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해 사이클은 피해야 한다.

Price and turnaround
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >2x1010 IFU/ml >1010 IFU/ml 250 ul (10x25 ul) $599 20-32 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $999
Large >2x1011 IFU/ml >1011 IFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,599
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x1012 VP/ml >1012 VP/ml 500 ul (10x50 ul) $1,999 22-36 days
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,399

IFU = Infectious units; VP = Virus particles

Deliverables
For non-ultra-purified scales For ultra-purified scales
Your custom chimeric Ad5/F35 adenovirus Your custom chimeric Ad5/F35 adenovirus

Free: control virus

  • Pilot: >1010 IFU/ml, 100 ul
  • Medium: >1010 IFU/ml, 2x100 ul
  • Large: >1010 IFU/ml, 2x100 ul

  Add-on purchase (optional): ultra-purified control virus

  • Ultra-purified medium: >1012 VP/ml, 10x50 ul, at $670
  • Ultra-purified large: >1012 VP/ml, 10x100 ul, at $800
Control virus

Control Ad5/F35 adenovirus 벡터는 custom 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, Ad5/F35 adenovirus transduction을 테스트하는데 사용된다. 예를 들어 custom 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control virus는 EGFP control Ad5/F35 adenovirus (Ad5/F35 adenovirus overxpressing EGFP)이고, custom 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공되는 control virus는 scramble shRNA를 발현한다. Control virus에 대한 자세한 정보는 다음과 같다.

Vector System Control Virus Vector Name Control Virus Vector ID
Ad5/F35 adenovirus gene expression system pAd5/F35[Exp]-CMV>EGFP VB010000-9301bcw
Shipping and storage

Non-ultra-purified adenovirus는 HBSS buffer에 보관되며, ultra-purified adenovirus는 GTS buffer에 보관된다. 모든 adenovirus는 드라이아이스로 운송된다. Adenovirus는 수령 즉시, 장기보관을 위해서는 -80℃ (1년 이상 안정 가능) 또는 단기 보관을 위해서는 -20℃ (예: 2-3주)에서 보관하여야 한다. Adenovirus는 다른 많은 바이러스(예: Lentivirus) 보다 안정성이 뛰어나고 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해 사이클은 피해야 한다.

Price and turnaround
Scale Application Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >1012 VP/ml 10x50 ul $1,299 22-36 days
Ultra-purified large 10x100 ul $1,599 22-36 days

VP = Virus particles

Deliverables
Your custom gutless adenovirus

Add-on purchase (optional): ultra-purified control adenovirus

  • Ultra-purified medium: >1012 VP/ml, 10x50 ul,at 440
  • Ultra-purified large: >1012 VP/ml, 10x100 ul,at 540
Control virus

Control gutless adenovirus 벡터는 custom 바이러스의 생물학적 응용과 일치하도록 디자인되어, gutless adenovirus transduction을 테스트하는데 사용된다. 예를 들어 custom 바이러스가 유전자를 과발현하는 경우, 제공되는 control virus는 EGFP control gutless adenovirus (gutless adenovirus overxpressing EGFP)이고, custom 바이러스가 유전자에 대해 shRNA를 발현하면 제공되는 control virus는 scramble shRNA를 발현한다. Control virus에 대한 자세한 정보는 다음과 같다.

Vector System Control Virus Vector Name Control Virus Vector ID
Gutless adenovirus gene expression system pGLAd[Exp]-CMV>EGFP VB010000-9400ggg
Shipping and storage

Non-ultra-purified adenovirus는 HBSS buffer에 보관되며, ultra-purified adenovirus는 GTS buffer에 보관된다. 모든 adenovirus는 드라이아이스로 운송된다. Adenovirus는 수령 즉시, 장기보관을 위해서는 -80℃ (1년 이상 안정 가능) 또는 단기 보관을 위해서는 -20℃ (예: 2-3주)에서 보관하여야 한다. Adenovirus는 다른 많은 바이러스(예: Lentivirus) 보다 안정성이 뛰어나고 여러번의 동결과 융해에도 바이러스 활성의 손실은 적지만, 실제로는 반복적인 동결-융해 사이클은 피해야 한다.

Technical Information

Human Ad5 adenovirus
Chimeric Ad5/F35 adenovirus
Gutless adenovirus
Adenovirus production and QC

재조합 adenovirus 제조의 경우 목적 유전자(GOI)를 운반하는 adenovirus 벡터는 우선 제한효소 PacI으로 선형화한다. 선형화된 벡터 DNA는 adenovirus 유전자 E1을 발현하는 packaging cell에 transfection하여 재조합 adenovirus를 생성하며, adenovirus 입자는 배양배지로 배출되어 채집된다. Ultra-purified adenovirus (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자가 더욱 정제되고 농축된다. 당사는 adenovirus-specific hexon protein을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정한다. Ultra-purified adenovirus의 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260을 사용하여)를 측정하여 titer를 추정한다.

VectorBuilder에서 생산하는 각각의 adenovirus에 대해 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출 등이 있다. 만약 adenovirus 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우 , 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행한다. 또한 ultra-purified adenovirus의 경우, endotoxin 수치를 체크하기 위해 endotoxin 분석을 수행한다.

Chimeric Ad5/F35 adenovirus production and QC

Chimeric Ad5/F35 adenovirus 제조(Figure 1)의 경우 목적 유전자(GOI)를 운반하는 Ad5/F35 adenovirus 벡터는 우선 제한효소 PacI 으로 선형화한다. 선형화된 벡터 DNA는 adenovirus 유전자 E1을 발현하는 packaging cell에 transfection하여 재조합 adenovirus를 생성하며, adenovirus 입자는 배양배지로 배출되어 채집된다. Ultra-purified adenovirus (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자를 더욱 정제하고 농축한다. 당사는 adenovirus-specific hexon protein을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정한다. Ultra-purified adenovirus의 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260사용)를 측정하여 titer를 추산한다.

Figure 1. Typical workflow of chimeric Ad5/F35 adenovirus packaging.

VectorBuilder에서 생산하는 각각의 adenovirus에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출이 있다. 만약 adenovirus 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우 , 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행한다. 또한 ultra-purified adenovirus의 경우, endotoxin 수치를 체크하기 위해 endotoxin 분석을 수행한다.

Ad5 adenovirus vs. chimeric Ad5/F35 adenovirus

Human adenovirus serotype 5 (Ad5) 벡터는 adenovirus 기반 응용에 가장 널리 사용되지만 이러한 벡터와 관련된 주요 한계는 표적 세포를 감염시키기 위한 coxsackie and adenovirus receptor (CAR)에 의존한다는 것이다. CAR의 발현이 완전히 결여되거나 불충분한 호스트 세포는 Ad5 벡터로 효율적으로 transduction될 수 없다. Ad5/F35 벡터는 adenovirus serotype 35(Ad35)에서 파생된 노브 및 샤프트와 Ad5에서 유래한 fiber tail로 구성된 chimeric fiber protein을 발현하여 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 된다. 이를 통해 Ad35 fiber protein이 non-CAR receptor인 CD46을 통해 타겟 세포에 부착되는 능력을 이용하여, Ad5/F35 adenovirus 벡터는 CAR 발현 수치가 높은 CAR-positive 세포 외에 CAR-negative 세포나 CAR 발현이 낮은 세포에도 쉽게 transduction할 수 있다. Ad5/F35 adenovirus의 키메라 디자인은 adenovirus 벡터의 tropism을 hematopoietic cells, primitive stem cells, vascular smooth muscle cells 및 CAR-negative tumor cell과 같은 기존의 Ad5 벡터로 좋지 않은 transduction을 보이는 세포주로 확장하는 데 매우 중요한 역할을 한다.

Experimental validation

Ad5/F35 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 다수의 독점 기술을 개발했다. 최적화된 Ad5/F35 adenovirus는 기존 Ad5 adenovirus에 비해 CAR 발현이 불충분한 세포에서 훨씬 더 높은 transduction효율을 나타내는 것으로 검증되었다(Figure 2).

Figure 2. K562 cells were transduced with EGFP expressing Ad5 or Ad5/F35 adenovirus at increasing MOI and EGFP positive cells were analyzed by flow cytometry at 48 hours post-transduction. K562 cells exhibit lows levels of CAR expression as shown by previous studies.

Gutless adenovirus production and QC

Gutless adenovirus 제조(Figure 1)의 경우 프로모터에 의해 구동되는 목적 유전자(GOI)를 포함하는 발현 카세트를 두 ITR 사이에 있는 gutless adenovirus 벡터에 우선 클로닝한다. 또한, 벡터는 두 inverted terminal repeats (ITRs) 사이에 28kb 이상의 최종 사이즈를 유지하기 위해 적절한 길이의 stuffer 서열을 포함하고, 이는 virion의 효율적인 패키징을 수행하는데 필요하다. 두 ITR이 인접된 벡터 영역은 제한효소 반응에 의해 plasmid에서 방출된다. 방출된 단편은 재조합 아데노바이러스 입자를 생성하기 위해 helper virus 로 감염되는 패키징 세포에 transfection 된다. Gutless adenovirus 벡터 시스템은 helper virus packaging signal의 Cre 매개 절단을 용이하게 하기 위해 Cre recombinase를 안정적으로 발현하는 패키징 세포와 함께 두 개의 LoxP 사이트에 인접한 packaging signal이 있는 helper virus를 활용한다. 이것은 helper virus 게놈이 gutless adenovirus 게놈과 함께 바이러스 입자로 패키징되는 것을 방지한다. Adenovirus 입자는 배양배지로 배출되어 채집된다.

Ultra-purified adenovirus (in vivo grade)의 경우 cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation에 의해 바이러스 입자를 더욱 정제하고 농축한다. 당사는 adenovirus-specific hexon protein을 검출하는 immunocytochemistry 기반의 방법을 사용하여 titer를 측정한다. Ultra-purified adenovirus의 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260 이용)를 측정하여 titer를 추산한다.

Figure 1. Typical workflow of gutless adenovirus packaging.

VectorBuilder에서 생산하는 각각의 adenovirus에 대한 품질관리에는 titer 측정, 박테리아 및 fungi에 대한 무균 테스트, mycoplasma 검출이 있다. 만약 adenovirus 벡터가 형광 단백질을 인코딩하는 경우 , 해당 형광을 검출하기 위해 transduction 테스트를 수행한다. 또한 ultra-purified adenovirus의 경우, endotoxin 수치를 체크하기 위해 endotoxin 분석을 수행한다.

Advantages of gutless adenovirus over Ad5 and Ad/F35 adenovirus

Gutless adenovirus 벡터(a.k.a. helper-dependent adenoviral vectors)는 기존 Ad5 또는 chimeric Ad5/F35 adenovirus 벡터에 비해 몇가지 장점을 제공하는 adenovirus 벡터이다. 바이러스 복제 및 패키징에 필수적인 cis-acting element를 제외하고 이러한 벡터에 거의 모든 바이러스 서열이 없기 때문에 gutless adenovirus 벡터는 in vivo에서 사용될 때 최소 면역원성과 장기간의 transgene 발현을 나타낼 수 있다. 따라서 Ad5 또는 Ad5/F35에 비해 안전성 프로파일이 크게 개선되어, 유전자 치료 응용 분야에 매우 매력적인 후보가 된다. 또한, 바이러스 코딩 서열이 없기 때문에 최대 33kb의 증가된 운반 능력을 가질 수 있으므로 매우 길거나 multiple transgene의 발현에 매우 적합하다. 아래 표에는 실험에 적합한 벡터를 선택하는 데 도움이 되도록 다양한 유형의 adenovirus 벡터 간의 차이점을 요약하였다.

Human Ad5 adenovirus Ad5/F35 adenovirus Ad5 gutless adenovirus
Structure Derived from human Ad5 adenovirus with the portion of the genome in between the ITRs lacking the E1A, E1B and E3 genes. Expresses a chimeric fiber protein comprised of the knob and shaft derived from Ad35 and the fiber tail derived from Ad5. Additionally, the portion of the genome between the two ITRs lack the E1A, E1B and E3 genes. Derived from human Ad5 and characterized by the absence of all viral sequences except cis-acting elements essential for viral replication and packaging.
Cargo capacity 7.5 kb 8.2 kb 33 kb
Tropism Dividing and non-dividing cells with low transduction efficiency in cells lacking or having insufficient CAR expression. Dividing and non-dividing cells with high transduction efficiency in both CAR positive and CAR negative cells. Dividing and non-dividing cells with low transduction efficiency in cells lacking or having insufficient CAR expression
Immune response in vivo High High Low
Helper virus needed No No Yes
Experimental validation

Gutless adenovirus 패키징 프로토콜을 최적화하기 위해 다수의 독점 기술을 개발했다. 당사의 최적화된 gutless adenovirus는 포유류 세포주에서 높은 transduction 효율을 나타내는 것으로 검증되었다.

Figure 2. HeLa cells were transduced with mcherry expressing gutless adenovirus at an MOI of 5000. Magnification: 100x. Left: bright field. Right: mcherry.

Technical documents
User Instructions Material Safety Data Sheet (MSDS) Certificate of Analysis (COA)

How to Order

Order both vector cloning and virus packaging
Order virus packaging of your own vector

Customer-supplied vectors

If customer-supplied lentiviral plasmids are used in packaging, please send them to us following the Materials Submission Guidelines. Please strictly follow our guidelines to set up shipment to avoid any delay or damage of the materials. All customer-supplied materials undergo mandatory QC by VectorBuilder which may incur $100 surcharge for each item. Please note that production may not be initiated until customer-supplied materials pass QC.

FAQ

What features does adenovirus have comparing to other viral vectors?
Lentivirus MMLV Adenovirus AAV
Tropism Broad Broad Ineffective for some cells Depending on viral serotype
Can infect non-dividing cells? Yes No Yes Yes
Stable integration or transient Stable integration Stable integration Transient, episomal Transient, episomal
Maximum titer High Moderate Very High High
Promoter customization Yes No Yes Yes
Primary use Cell culture and in vivo Cell culture and in vivo In vivo In vivo
Immune response in vivo Low Low High Very low
How is viral titer determined in VectorBuilder?

For adenovirus, we measure the functional titer. After transducing serially-diluted adenovirus into 293A cells, we use an immunocytochemistry-based approach to count the number of cells being successfully transduced via the detection of adenovirus-specific hexon protein, and each immunostained cell is considered as one infectious unit. Cells are infected at very low multiplicity of infection (MOI) to ensure that most transduced cells are each infected by a single viral particle. This assay shows good correlation with conventional plaque assay. For ultra-purified adenovirus, we directly measure the optical density (using OD260) of the viral particles to estimate titer, because there is a tight correlation between the optical density of ultra-purified adenovirus and functional titer. Adenovirus has very good stability. In our preparation, the viral particles are essentially all alive and can remain functional at room temperature for many days.

What is VectorBuilder's guarantee for virus titer and turnaround?

We guarantee the minimum titer when the region of the vector being packaged into virus (from 5’ ITR to 3’ ITR) is below the adenovirus cargo limit (38.7 kb). For sizes above this, the adenoviral genome may be unstable, and rearrangement may occur during packaging. Additionally, we are not able to guarantee titer for the following vectors:

  • Vectors containing sequences that could adversely affect the packaging process such as toxic genes (e.g. proapoptotic genes), genes that compromise the integrity of packaging cells or virus (e.g. membrane proteins that cause cell aggregation), and sequences prone to rearrangements or secondary structures (e.g. repetitive or highly GC-rich sequences);
  • Customer-supplied plasmids containing undisclosed sequences or atypical adenoviral functional elements (e.g. ITR) that may introduce uncertainties to packaging efficiency.

The estimated turnaround is the time from production initiation to completion. It does not include waiting time for any customer-supplied materials (e.g. template DNA or viral vectors), QC of such materials, and transit time for shipping final deliverables to the customer.