치료용 RNA 개발

RNA는 RNA 백신, CRISPR 유전자 편집, CAR-T를 포함한 T세포 치료제 등 다양한 치료 분야에서 유망한 기술로 부상하고 있습니다. VectorBuilder는 아이디어 (concept) 단계부터 임상 (clinic) 단계까지 고객의 RNA 개발 프로젝트를 지원하는 포괄적인 엔드투엔드 RNA 플랫폼을 제공하며, IVT 벡터 디자인부터 기능 검증, GMP 제조에 이르기까지 개발의 모든 단계를 지원하고 있습니다.

주요 특징

통합된 기술 전문성

RNA 및 LNP 치료제 개발의 전 단계에 걸쳐 전문적인 기술 가이드를 제공하여 모든 적용 분야에서 성능 극대화.

엔드 투 엔드 솔루션

원스톱 IVT 벡터 디자인, 생산 및 기능 검증 서비스를 통해 치료용 RNA 개발을 효율화.

CRISPR 응용

정밀하고 효율적인 유전자 편집을 위해 in vitro 및 in vivo 모두에서 RNA 디자인과 LNP 전달을 최적화해 온 풍부한 경험 보유.

CAR-T 개발

Ex vivo 및 in vivo T세포 엔지니어링을 위해 IVT RNA를 사용하여 신속하고 일시적이며 강력한 CAR 발현 구현.

VectorBuilder는 RNA 치료제의 설계, 최적화, 검증 그리고 생산까지
모든 과정을 한 곳에서 빠르게 수행할 수 있도록 지원합니다.

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치료용 IVT RNA 개발 워크플로우

IVT 벡터
디자인 & 클로닝

IVT RNA 생산

LNP Encapsulation

품질관리 (QC)

기능 검증

IVT RNA 벡터의 최적 설계는 치료용 RNA 개발의 핵심입니다. VectorBuilder는 GVP (Good Vector Practice)와 광범위한 RNA 엔지니어링 전문성을 적용하여, 설계 초기 단계에서부터 발현율, 안정성, 효능과 같은 중요한 품질 고려사항을 해결하고, 이를 통해 각 RNA 치료제가 개발 시작부터 최적의 성능을 발휘할 수 있게 합니다.

VectorBuilder는 다양한 응용 분야를 위해 mRNA, saRNA, circRNA 및 기타 small RNA를 포함한 여러 모달리티를 제공합니다. 또한, VectorBuilder의 기술 지원팀은 적절한 IVT 백본을 선택하고 코딩 서열, 5'/3' untranslated region (UTR), polyA tail, Kozak 서열과 같은 주요 RNA 구성요소를 최적화할 수 있도록 지원하고 있습니다.

VectorBuilder는 IVT RNA 생산 공정을 효율화하기 위해 일련의 독자적인 기술과 시약을 개발했으며, 다양한 스케일과 임상 요구사항을 충족할 수 있는 확장 가능한 플랫폼을 갖추고 있습니다. VectorBuilder는 개발 초기 단계부터 치료 효능을 극대화하기 위해, in vivo 발현율을 높이고 면역원성을 최소화하는 다양한 capping 방법, 뉴클레오타이드 수식 (nucleotide modification), 그리고 고효율의 독자적인 정제 전략을 제공합니다. 또한 대규모 RNA 생산을 위한 cell-free 또는 animal-free 공정 방식도 이용 가능합니다.

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LNP (지질 나노입자, lipid nanoparticles)는 RNA의 안정성을 유지하고 효율적인 세포 전달을 촉진하기 때문에, RNA 치료제의 효능을 확보하는 데 필수적인 요소입니다. VectorBuilder는 높은 encapsulation 효율을 갖춘 균일한 (homogeneous) LNP를 생산하는 데 탁월한 기술력을 보유하고 있습니다. 특히, RNA 치료제의 조직 특이성 (tissue specificity)과 효능을 극대화하기 위해, LNP 제형 (formulation) 최적화 및 조직 특이적 항체 접합 (conjugation)과 같은 LNP 표면 엔지니어링 분야에 특화되어 있습니다.

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일관된 품질과 성능을 갖춘 RNA 치료제를 제공하기 위해서는 엄격하고 체계적으로 설계된 품질관리 (QC) 조치가 필수적입니다. RNA의 온전성 (integrity), 무균성 (sterility) 및 순도 (예: endotoxin 및 잔류 dsRNA)는 전임상 및 임상 적용에 있어 중요한 품질 특성입니다. VectorBuilder는 IVT RNA와 LNP-encapsulated RNA 및 plasmids에 대해 포괄적이고 완벽한 커스텀 QC 솔루션을 제공하여 제품의 신뢰성, 안전성 및 효능을 보장합니다.

고객의 RNA 개발이 아이디어 단계부터 실제 적용 단계로 이어지는 과정을 효율화하기 위해, VectorBuilder 전문가들은 CRISPR, CAR 발현, 암 치료 등 다양한 응용 분야에서 RNA 치료제의 효율성, 효능 및 안전성을 평가하는 기능 검증 연구를 in vitro 및 in vivo에서 수행할 수 있도록 지원합니다. In vivo 검증의 경우, 설치류 및 비인간 영장류 (non-human primate, NHP)를 포함한 다양한 동물 모델을 사용하여 연구를 진행할 수 있습니다.

CRISPR 게놈 편집

CRISPR IVT RNA는 다양한 세포 유형에서 프로모터 비의존적 (promoter-independent) 편집, 게놈 삽입 (genomic integration) 리스크의 배제, 그리고 오프 타겟 효과 (off-target effects)를 최소화하는 일시적 발현 (transient expression) 등 여러 장점으로 인해, 유전자 편집 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 또한, Cas9 mRNA와 gRNA를 LNP에 함께 co-encapsulation할 수 있어 기존 벡터 시스템에 비해 in vitro 및 in vivo에서 더욱 효율적인 유전자 전달 및 편집이 가능합니다.

Find more about our collection of fully-validated research-grade premade CRISPR RNA products.

Codon-Optimized HiExpress™ RNA

VectorBuilder는 벡터 디자인 및 엔지니어링 분야의 풍부한 전문성을 바탕으로, 타겟 단백질 발현 및 유전자 편집 효율을 획기적으로 향상시키는 서열 최적화된 HiExpress™ hSpCas9 및 adenine base editor (ABE) RNA 제품을 개발했습니다.

HiExpress™ hSpCas9
HiExpress™ ABE

HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA developed by VectorBuilder has high expression and editing efficiency_2

Figure 1. VectorBuilder에서 개발한 HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA는 human Cas9 변이체 중 가장 높은 유전자 발현 및 편집 효율을 보입니다. hSpCas9 IVT mRNA, HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA 또는 무처리 대조군 (NC) 1 μg을 HEK293T 세포에 transfection한 후 24시간에 (A) Western blot 분석 및 (B) hSpCas9 대비 Cas9 발현양을 정규화 (normalized)한 결과. (C) gRNA 1 μg과 표시된 양의 hSpCas9 또는 HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA를 HEK293T 세포에 transfection한 후 24시간에 T7E1 editing assay. 파란색 별표는 온전한 PCR 증폭 산물을 나타내고, 분홍색 화살표는 T7E1에 의해 생성된 단편을 나타냅니다. 따라서 HiExpress™ RNA는 더 적은 양으로도 세포 내에서 동등한 수준의 편집 효율을 달성할 수 있으므로, 치료제 개발 및 생명공학 응용 분야의 유전자 편집에 최적화되어 있습니다.

Validation of Adenine Base Editor (ABE) mRNAs in vitro

Figure 2. VectorBuilder의 HiExpress™ ABE mRNA는 in vitro에서 탁월한 염기 편집 효율을 나타냅니다. (A) ABE8.20-m 및 (B) ABE7.10을 암호화하는 mRNA를 각각 동일한 gRNA와 함께 HEK293T 세포에 co-transfection 하였습니다. Transfection한 후 48시간에 게놈 DNA를 추출하고, 타겟 영역을 PCR로 증폭한 후 NGS 분석을 수행하였습니다. 편집 윈도우 (editing windows) (점선) 내에서 A에서 G로의 편집 (별표)이 검출되었습니다. 5번째 뉴클레오타이드에서 각각 (A) 97.7% 및 (B) 95.6%의 최고 편집률을 달성하였습니다.

In Vivo Knockout

In vivo CRISPR IVT RNA knockout.

Figure 3. In vivo 유전자 knockout을 위한 VectorBuilder의 CRISPR RNA 솔루션. (A) In vivo CRISPR IVT RNA knockout 실험 일정. 마우스에 LNP로 co-encapsulation된 Cas9 mRNA/gRNA 혼합물 3.0 ug/g 또는 PBS를 정맥주사 (Intravenously injected) 하였습니다. 7일차에 간에서 게놈 DNA를 추출하고 PCR 증폭 후 T7E1 분석을 통해 유전자 편집을 확인했습니다. (B) T7E1 분석의 겔 전기영동 결과에서 편집이 확인되었습니다 (별표 표시된 밴드). 각 레인은 하나의 생물학적 반복 개체를 나타냅니다.

In Vitro Knockout

Single-gRNA
Dual-gRNA

Figure 4. Single gRNA를 이용한 in vitro CRISPR 매개 유전자 knockout. (A) IVT Cas9 mRNA와 EGFP 타겟하는 두 종류의 gRNA를 함께 HEK293T-EGFP 세포에 transfection 하였습니다. 무처리 대조군 (NC) 세포와 transfection된 세포에서 EGFP 발현을 현미경으로 관찰하고 (B), flow cytometry를 이용하여 정량화 하였습니다 (C, D). (E, F) 게놈 상의 EGFP 유전자 편집 여부는 T7E1 분석 및 Sanger 시퀀싱을 통해 추가로 확인하였습니다.

Validation_of_hSpCas9_mRNA_knockout_with_dual_gRNAs

Figure 5. Dual gRNA를 이용한 in vitro CRISPR 매개 유전자 knockout. (A) Cas9을 암호화하는 벡터를 선형화 (linearized )하고 in vitro transcription을 수행하여 Cas9 mRNA를 생성한 후, 동일한 유전자를 타겟으로 하는 두 개의 gRNA와 함께 NIH/3T3 세포에 co-transfection 하였습니다. (B) 관심 유전자의 exon 2-4를 타겟으로 하는 gRNA의 상세 실험 설계. Primer 쌍 P1과 P2는 타겟 사이트 주변 영역을 증폭하기 위한 PCR 검증용으로 설계되었습니다. (C) PCR로 증폭된 게놈 DNA의 겔 전기영동을 통해 유전자 편집 여부를 확인하였습니다.

CAR-T 치료

CAR-T 치료는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하도록 유전자가 조작된 T 세포를 이용하여 암 및 자가면역질환과 같은 임상 질환을 치료하는 방법입니다. 최근에는 일시적인 (transient) 발현, 제조 용이성, 그리고 낮은 면역원성이라는 장점 때문에, ex vivo 및 in vivo에서 T 세포에 CAR을 전달하고 발현시키는 수단으로 IVT RNA가 점차 널리 사용되고 있습니다. 렌티바이러스와 같은 특정 바이러스 벡터와 비교했을 때 RNA는 타겟 세포의 게놈에 삽입 (integrate)되지 않아서, 결과적으로 생성되는 CAR-T 세포는 일시적으로만 활성을 띠게 되어 삽입 돌연변이 (insertional mutagenesis) 및 장기적인 독성 위험을 최소화합니다. 이러한 안전성은 RNA의 빠른 생산 속도와 경제적인 비용과 결합하여, 초기 단계 개인 맞춤형 전임상 시험에 매우 적합합니다. 또한, LNP encapsulation은 CAR 컨스트럭트의 효율적이고 표적화된 전달을 보장하여, in vivo CAR-T 개발에 더욱 매력적인 솔루션이 되고 있습니다. VectorBuilder의 포괄적인 LNP-RNA 플랫폼은 CAR 컨스트럭트의 설계, 최적화 및 검증을 지원하여, 고객의 CAR 개발을 아이디어 단계에서 실제 적용까지 가속화합니다.

완벽히 검증된 연구용 premade CAR RNA 제품군에 대해 자세히 알아보세요. 또는 직관적인 Vector Design Studio CAR 발현 벡터를 확인하고, 직접 벡터를 디자인해 볼 수도 있습니다.

mRNA UTR optimization validation

Figure 6. VectorBuilder의 LNP-mRNA를 사용하여 제작된 human CAR-T 세포는 CD19+ 세포에 대한 세포독성을 나타냈습니다. (A) Primary human T 세포에 LNP encapsulated anti-CD19 CAR mRNA를 transfection 하였습니다. CAR-T 세포의 세포 살해능 (killing function)은 CD19+ Raji 세포와 함께 배양한 뒤 방출된 lactate dehydrogenase (LDH)를 측정하여 검증하였습니다. (B) 서로 다른 co-stimulatory domain인 4-1BB (CD19-BBz, 1949 nt) 또는 CD28 (CD19-28z, 1931 nt)을 포함하는 anti-CD19 CAR를 암호화하는 두 종류의 IVT mRNA를 LNP에 encapsulation 하였습니다. (C) 활성화된 (activated) human T 세포에 각각의 LNP-mRNA를 transfection하고 CD19 CAR 발현 여부를 검증하였습니다. (D) CAR-T 세포와 Raji 세포를 다양한 효과기 대 표적 (effector-to-target, E:T) 비율로 함께 배양한 후 18시간에 LDH 분석을 통해 T 세포 유도 세포독성 (T cell-induced cytotoxicity)을 측정했습니다.

Incorporation of a miR-122 targeting site into the 3 UTR reduces liver specific expression of IVT mRNA

Figure 7. 최적화된 LNP 제형은 primary human T 세포에서 RNA transfection 효율을 증가시킵니다. (A) 활성화된 (activated) T 세포에 1×10⁶ 세포당 6 μg mRNA로, LNP-encapsulated EGFP mRNA를 transfection 하였습니다. (B) Encapsulation 전, 변성 (denaturing) 아가로스 겔 전기영동을 통해 EGFP mRNA의 길이와 온전성 (integrity )을 확인하였습니다. (C) T 세포 transfection 전, LNP의 입자 사이즈와 제타 전위 (Zeta potential)를 측정하였습니다. (D) Transfection 후 24시간에 형광 현미경과 flow cytometry를 이용하여 EGFP 발현을 이미징하고 분석하였습니다.

CRISPR 및 CAR-T 외에도 차세대 암 치료를 위한
mRNA 백신과 T 세포 인게이저 개발을 지원합니다.

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정보 자료

FAQ

CRISPR 시스템 전달에 IVT RNA를 사용하는 이유는 무엇일까요?

CRISPR-Cas9는 plasmid, 재조합 바이러스, gRNA-Cas9 RNP 복합체, 그리고 gRNA와 Cas9 IVT mRNA 혼합물 등 다양한 방법을 통해 전달될 수 있습니다. 각 방법에는 고유의 장점과 한계가 있으며, 연구자들은 자신의 연구 목적에 맞춰 효율은 극대화하고 off-target 및 원치 않는 효과를 최소화할 수 있는 방법을 선택할 수 있습니다. 그중에서도 IVT RNA는 가장 유망한 접근법으로 급부상하고 있습니다.

Plasmid는 일반적으로 저렴한 비용으로 대량 생산이 쉽고, chemical transfection이나 electroporation을 통해 간단하게 전달할 수 있습니다. 그러나 이러한 전달 방식의 특성상 주로 in vitro 실험에 국한된다는 한계가 있습니다. 또한, plasmid transfection 효율은 세포 유형에 따라 크게 다를 수 있으며, 발현이 세포 유형별 promoter 활성에 의존하기 때문에 특정 시스템에서는 효율이 떨어질 수 있습니다. 결과적으로, plasmid는 강력한 활성을 가진 promoter를 사용하는 경향이 있는데, 이는 Cas9의 과도한 발현을 유발하여, off-target 편집 및 호스트 게놈 내로 plasmid DNA가 무작위 삽입 (integration) 될 위험을 높일 수 있습니다.

재조합 바이러스는 CRISPR 구성요소를 전달하는 또 다른 인기 있는 방법으로, transfection이 어려운 세포에서도 사용할 수 있고, 다중 gRNA 실험을 위해 안정적으로 Cas9를 발현하는 세포주를 만들 수 있습니다. 하지만 이 시스템은 plasmid 전달과 마찬가지로 세포 유형 의존적 promoter 특이성 문제와 장기간의 Cas9 발현으로 인한 오프타겟 효과 증가라는 한계를 가지고 있습니다. 또한, 재조합 바이러스는 삽입 변이 (insertional mutagenesis)가 발생할 위험이 높으며, 특히 레트로바이러스 및 렌티바이러스 시스템의 경우 Cas9 도입 유전자가 게놈 삽입 (genomic integration) 되는 문제가 발생할 수 있습니다.

gRNA-Cas9 RNP 복합체 전달은 plasmid 및 재조합 바이러스 시스템의 많은 한계를 극복하여 transcription 및 translation 과정이 필요 없기 때문에 신속한 편집이 가능합니다. 하지만 이 방법은 효율적인 전달을 위해 electroporation이 필요하기 때문에 주로 in vitro 적용에 국한됩니다. 이 방법을 통한 유전자 편집은 빠르게 진행되지만, 호스트 세포 내에서 Cas9이 분해됨에 따라 편집 효과가 급격히 감소하므로, Cas9 단백질의 가용성 (availability)에 따라 적용 범위가 제한됩니다.

앞선 방법들과는 대조적으로, gRNA와 Cas9 IVT mRNA 혼합물을 전달하는 방식은 오프타겟 (off-target) 효과를 최소화하면서 가장 효율적인 게놈 편집 방법 중 하나로 빠르게 부상하고 있습니다. gRNA와 Cas9 IVT mRNA는 지질 나노입자에 co-encapsulation 하거나 화학적 transfection 시약을 사용하여 전달 할 수 있어, 게놈 삽입 (genomic integration) 위험 없이 in vitro 및 in vivo 응용 분야 모두에 적합합니다. 또한, 전사 과정이 필요 없어 세포 유형 특이적 promoter 활성에 관계없이 발현이 가능하며, 번역이 비교적 빠르게 일어나 신속하고 효율적인 유전자 편집이 가능합니다. gRNA-Cas9 RNP 복합체와 비교했을 때, mRNA는 Cas9의 발현을 더 오랫동안 유지시켜 지속적인 유전자 편집을 가능하게 합니다. 그러나 mRNA는 결국 분해되므로 유전자 편집은 일시적으로만 일어나 오프타겟 효과 발생을 억제할 수 있습니다.

요약하자면, plasmid, 재조합 바이러스 및 gRNA-Cas9 RNP 복합체 방법을 통한 CRISPR-Cas9 구성요소 전달은 제한적인 효율성, 오프타겟 효과의 위험 증가, 삽입 변이 유발 가능성 등의 단점이 있어 그 활용 범위가 제한적입니다. 반면, gRNA와 Cas9 IVT mRNA 혼합물 전달은 수많은 장점과 적은 한계로 인해 가장 효율적인 게놈 편집 방법 중 하나로 부상했으며, 게놈 편집 응용에 우선적으로 고려되어야 합니다.

CRISPR 매개 knockout에는 single gRNA와 dual gRNA 중 무엇을 사용해야 할까요?

CRISPR 매개 게놈 편집에서 Cas9 nuclease는 게놈 내 부위 특이적 guide RNA (gRNA)의 타겟 부위로 이동하여 DNA를 절단 (cleavage) 합니다. 대부분의 경우, 단순 유전자 knockout을 위해 single gRNA를 Cas9와 함께 사용하여 DSB (double-strand break)을 유발합니다. 이렇게 생성된 DSB는 NHEJ (non-homologous end joining)에 의해 복구되는데, 이 과정은 불완전하여 (inefficiently) 복구 부위에 작은 삽입 (insertion)이나 결실 (deletion)과 같은 영구적인 돌연변이를 남깁니다. 이러한 돌연변이 중 일부는 frameshift, 조기 종결 코돈 (premature stop codon) 등을 유발하여, 관심 유전자의 기능을 상실하게 만듭니다.

Dual gRNA는 Cas9_D10A nickase를 사용하여 단일 타겟 부위의 두 반대 가닥을 공략할 때 사용할 수 있습니다. 이 방법에서는 nickase 효소가 두 개의 gRNA에 의해 각각 유도되어 양쪽 가닥에 single strand cut을 일으키며, 결과적으로 타겟 부위에 DSB를 생성하게 됩니다. 일반적으로 이 방법은 DSB 생성을 위해 두 gRNA의 표적화가 모두 필요하기 때문에, CRISPR/Cas9 발현의 오프타겟 (off-target) 효과를 감소시킵니다.

또한, Cas9_D10A nickase와 외래 (exogenous) donor DNA 템플릿을 사용하여 관심 유전자에 특정 염기 변화 (예: knockin)를 도입할 때도 dual gRNA를 사용할 수 있습니다. 이 방법에서는 두 개의 gRNA가 원하는 변이 부위의 양쪽 측면을 각각 타겟으로 삼아 반대 가닥을 공략하며, HDR (homology-directed repair) pathway를 통해 외래 donor 템플릿을 이용하여 절단된 서열을 복구합니다.

RNA 기반 CAR-T 솔루션은 바이러스 및 다른 비바이러스 전달 시스템과 비교했을 때 어떤 점이 다를까요?

LNP-mRNA, 렌티바이러스 및 piggyBac 기반 CAR-T 전달 시스템에 대한 상세한 비교를 아래 표에 정리했습니다.

Feature	LNP-mRNA	Lentivirus	PiggyBac Transposon
Delivery route	Ex vivo or in vivo.	Usually ex vivo.	Ex vivo.
Cell specificity	Intrinsic LNP tropism is often liver; T-cell targeting requires formulation/ligands (e.g. antibody) for ex vivo and in vivo use.	Pseudotyping (e.g. VSV-G) gives broad tropism; ex vivo transduction of isolated T cells is routine and highly effective.	Delivered into T cells via electroporation, which shows high efficiency when optimized.
Expression time	Transient. Expression begins within hours and lasts for days up to ~1 week. Repeated dosing yields repeated expression.	Stable, long-term expression due to host genome integration; expression lasts for months to years (effectively permanent in dividing T cells).	Stable, long-term genomic integration when transposase mediates insertion; expression persists like viral integration unless excised.
Safety	No insertional mutagenesis risk.	Risk of insertional mutagenesis due to genomic integration, which raises concerns for clinical use.	Risk of insertional mutagenesis due to stable integration into TTAA sites, which raises concerns for clinical use.
Cargo capacity	LNPs can deliver 4-10 kb of large mRNAs; longer mRNAs show reduced stability and translation efficiency.	Up to 9.2 kb; larger constructs compromise titer and transduction efficiency.	Very large capacity; can accommodate up to ~30 kb of DNA.
Immunogenicity	No viral proteins are produced so overall lower adaptive anti-vector immunity. mRNA and LNPs can sometimes stimulate innate immunity; nucleoside modifications and optimized lipids reduce immunogenicity.	Viral proteins (especially residual from vector prep) and integrated transgene expression can elicit immune responses. Patients can develop anti-vector or anti-CAR immune responses.	No viral proteins are produced so overall lower adaptive anti-vector immunity. Delivery via electroporation avoids viral proteins but electroporation itself causes cell stress.
Dosage controllability	High controllability due to transient expression. Dosing can be titrated (i.e. dose and frequency), which enables repeated administrations. Good for short-term programs or on-demand CAR expression to limit toxicity.	Low controllability once integrated due to persistent expression. Extensive additional engineering (e.g. regulated promoters or safety switches) is necessary to systematically control CAR expression.	Low controllability once integrated due to persistent expression. Extensive additional engineering (e.g. regulated promoters or excisable transposons) is necessary to systematically control CAR expression.