shRNA Gene Knockdown Solutions

VectorBuilder는 RNAi 실험에 이상적인 도구를 제공하기 위해 포괄적인 shRNA 시약 컬렉션을 제공한다. 실험적 필요에 따라 다양한 방식으로 shRNA 발현을 제어할 수 있는 유연성을 제공하기 위해 U6 및 miR30 기반 shRNA 시스템을 모두 제공한다. shRNA를 transfection이 어려운 세포에 전달하기 위해 주요 바이러스 유형 (예: lentivirus, AAV, adenovirus)을 다양한 titer 스케일로 패키징할 수 있다. 또한 포유류 세포에서 대규모 기능 상실 스크리닝을 위한 pooled shRNA library를 전문적으로 제작할 수 있다. 아울러 온라인 벡터 디자인 플랫폼은 인기있는 종에 대한 shRNA 데이터베이스와 통합되어 목적 유전자 (GOI)를 타겟으로 하는 적합한 shRNA를 쉽게 선별할 수 있다.
Highlights
  • shRNA 벡터의 빠르고 쉬운 디자인를 위한 전체 게놈 shRNA 데이터베이스가 있는 매우 직관적인 온라인 디자인 플랫폼
  • 벡터 backbone 및 벡터 컴포넌트의 풍부한 컬렉션
  • Premade 및 맞춤 제작 shRNA library 사용 가능
  • 100% 서열 검증, 빠른 소요시간 및 경쟁력 있는 가격
  • shRNA 선택, 벡터 디자인 및 문제 해결을 위한 강력한 기술지원
Offering Details
  • Custom shRNA vectors
  • Popular shRNA vectors
  • shRNA virus
  • shRNA (3+1) virus packaging
  • Pooled shRNA libraries
  • shRNA knockdown stable cell lines
Technical Information
  • shRNA-mediated gene knockdown
  • Controlling shRNA expression
  • shRNA databases

Offering Details

Custom shRNA vectors

직관적인 온라인 벡터 디자인 플랫폼을 사용하여 shRNA 발현을 위한 30개 이상의 벡터 backbone (non-viral, viral 또는 transposon)과 벡터 컴포넌트 (promoters, fluorescent 및 drug-selection markers)의 조합 중에서 선택할 수 있다. 당사의 shRNA 데이터베이스를 사용하면 직접 디자인할 필요없이 GOI에 대해 shRNA를 쉽게 선택할 수 있다. 또한 관심있는 shRNA의 knockdown 효율을 테스트하기 위한 shRNA sensor 벡터를 제공한다.

Plasmid DNA preparation 및 바이러스 패키징은 shRNA 벡터 디자인 완료시 downstream 서비스로 구매할 수 있다.

Choose your custom shRNA vectors View more

In addition to the vector systems listed above, we can design and construct IPTG-inducible shRNA expression vectors and Cre-lox based conditional shRNA expression vectors. Just send us a design request!

Click to view detailed information on our vector construction services
Popular shRNA vectors

VectorBuilder는 많은 생물학적 응용 분야에서 control 벡터로 사용하기 적합한 scramble shRNA 또는 인기 유전자를 타겟으로 하는 shRNA를 발현하는 shRNA 벡터 패널을 제공한다. Plasmid DNA preparation 및 바이러스 패키징은 이러한 벡터를 shopping cart에 추가할 때 downstream 서비스로 구입할 수 있다.

아래 Vector Picker를 사용하여 U6 기반 인기 shRNA 벡터를 주문할 수 있다.

miR30 기반 인기 shRNA 벡터를 주문하려면, 요구사항을 디자인 의뢰하기로 보내주세요.

shRNA virus

VectorBuilder는 shRNA를 transfection이 어려운 세포에 전달하기 위해 다양한 스케일로 lentivirus, AAV 및 adenovirus에 대한 프리미엄 품질의 바이러스 패키징 서비스를 제공한다. 당사의 독점 기술과 시약은 titer, 순도, 생존력 및 일관성 측면에서 바이러스 패키징 프로토콜을 크게 개선하였다. 당사의 패키징 프로토콜은 벡터 제작 서비스에 사용되는 바이러스 벡터 시스템에도 최적화되어 있다. 그 결과 클로닝 및 바이러스 패키징 니즈에 충족하는 고객들이 반복적으로 주문하는 경우가 많아지고 있다.

Price, turnaround and scales of lentivirus packaging services View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >4x10TU/ml >10TU/ml 250 ul (10x25 ul) $399 8-16 days
Medium >3x10TU/ml 1 ml (10x100 ul) $599
Large >2x10TU/ml >10TU/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x10TU/ml >10TU/ml 500 ul (10x50 ul) $1,299
Ultra-purified large 1 ml (10x 100 ul) $1,599

TU = Transduction units (also known as infectious units)

Price, turnaround and scales of AAV packaging servicesView more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >1012 GC/ml >2x1011 GC/ml 250 ul (10x25 ul) $399 10-18 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $599
Large >5x1012 GC/ml >2x1012 GC/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo >2x1013 GC/ml >1013 GC/ml 100 ul (4x25 ul) $1,199 16-26 days
Ultra-purified medium 500 ul (10x50 ul) $1,799
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,799

GC = Genome copies

Price, turnaround and scales of adenovirus packaging services View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >2x1010 IFU/ml >1010 IFU/ml 250 ul (10x25 ul) $399 20-32 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $599
Large >2x1011 IFU/ml >1011 IFU/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x1012 VP/ml >1012 VP/ml 500 ul (10x50 ul) $1,299 22-36 days
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $1,599

IFU = Infectious units; VP = Virus particles

Click to view detailed information on our virus packaging services

shRNA (3+1) virus packaging

경험적으로 디자인된 shRNA는 그중 일부가 작동하지 않을 수 있다는 사실을 인식하는 것이 중요하다. shRNA의 효능은 shRNA의 길이, loop 구조, shRNA의 GC 프로파일 및 열역학적 안정성, 타겟 서열의 2차 구조, 다른 유전자와의 off-target 일치를 포함한 여러 요인에 의해 결정된다. 일반적으로 shRNA의 ~ 50-70%는 눈에 띄는 knockdown 효과를 가지며, 그 중 ~ 20-30%는 강한 knockdown 효과를 갖는다. 따라서 downstream 실험에서 가장 강력한 shRNA를 찾기 위해 여러 shRNA를 테스트하는 것이 중요하다.

VectorBuilder는 GOI를 타겟으로 하는 3개의 custom shRNA 바이러스와 1개의 scramble control 바이러스를 포함하는 shRNA (3 + 1) 바이러스 패키징 서비스를 제공하며, 매우 경제적인 가격으로 타겟 유전자에 대해 여러 shRNA를 테스트할 수 있다. 이 서비스는 현재 lentivirus, AAV 및 adenovirus에 사용할 수 있다.

Price, turnaround and scales of shRNA (3+1) virus packaging services View more
Virus Type Scale & Deliverable  Application Price (USD)* Turnaround**
Lentivirus Pilot Cell culture $1,248 15-28 days
Medium $1,748
Large $2,748
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo $3,948
Ultra-purified large $4,748
AAV Pilot Cell culture $1,248 17-30 days
Medium $1,748
Large $2,748
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo $3,848 23-38 days
Ultra-purified medium $5,348
Ultra-purified large $8,148
Adenovirus Pilot Cell culture $1,648 32-50 days
Medium $2,148
Large $3,148
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo $4,348 34-54 days
Ultra-purified large $5,148

* Price includes the cost of both vector construction and virus packaging.

** Turnaround includes the production time for both vector construction and virus packaging.

Use the ordering tool below to order shRNA (3+1) virus packaging for your target genes

위의 Vector Picker는 U6 기반 shRNA 벡터에만 적용된다. miR30 기반 shRNA 벡터가 필요하거나 Vector Picker를 사용하여 대상 유전자에 대해 원하는 shRNA를 찾을 수 없는 경우, 요구사항을 디자인 의뢰하기로 보내주세요.

Pooled shRNA libraries

Pooled shRNA library는 질병 경로, 약물 치료에 대한 세포 반응, 발생 과정, 유전자 조절 등에 관련된 유전자에 대한 대규모 기능 손실 스크리닝을 수행하기 위한 강력하고 비용 효율적인 도구로 사용할 수 있다. 필요에 따라 E. coli stock, plasmid DNA pool 또는 packaged virus 형태로 library를 제공할 수 있다. 당사의 맞춤형 library는 NGS를 통해 완벽하게 검증되어, 무엇을 얻었는지 정확히 알 수 있다.

Pooled shRNA library 제작 외에도 VectorBuilder는 인간 및 마우스 유전자를 대상으로 하는 고품질의 premade pooled shRNA library를 제공한다. 각 종에 대해 바로 사용 가능한 lentivirus library를 2가지 스케일로 제공한다: Whole Genome (~ 19,000 RefSeq genes) 및 Elite Gene (~2,000 most frequently cited genes on PubMed Central). 가능한 경우 각 유전자는 5-6개의 서로 다른 shRNA에 의해 타겟팅된다. 이러한 library는 NGS 및 기능 분석을 통해 완전히 검증되었다.

Highlights of our premade shRNA libraries:

  • Whole-genome and high-coverage targeting
  • Validation of library quality by NGS
  • High uniformity
  • Available as ready-to-use high-titer lentivirus
  • Dual EGFP/Puro marker for efficient and versatile selection or tracking of positively transduced cells
Price and turnaround of premade shRNA librariesView more
Product Name No. of genes No. of shRNAs Scale* Catalog No. Price (USD)
Human Elite Gene Pooled shRNA Library 2,161 12,471 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1037bjk) $4,999
$2,499
Mouse Elite Gene Pooled shRNA Library 2,233 12,472 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1039sgb) $4,999
$2,499
Human Whole Genome Pooled shRNA Library 18,432 92,917 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1038ngq) $4,999
$2,499
Plus
(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)
LV5M(Lib190505-1038ngq) $14,999
$7,499
Mouse Whole Genome Pooled shRNA Library 19,790 92,917 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1042tfx) $4,999
$2,499
Plus
(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)
LV5M(Lib190505-1042tfx) $14,999
$7,499

* For Elite Gene libraries, the medium scale is sufficient for >40 screens at 100x shRNA coverage. For Whole Genome libraries, the medium scale is sufficient for >5 screens at 100x shRNA coverage, and the plus scale is sufficient for >25 screens at 100x shRNA coverage.

shRNA knockdown stable cell lines

VectorBuilder는 GOI의 장기간 knockdown이 필요한 응용 분야를 위해 shRNA knockdown stable cell line을 맞춤형으로 제작할 수 있다. GOI의 효율적인 knockdown을 보장하기 위해 knockdown 스코어를 기반으로 한 상위 3개의 후보 shRNA가 테스트되고 최고의 knockdown 효율을 가진 shRNA가 lentivirus transduction을 통해 stable cell line을 생성하는데 사용된다. Cell line의 knockdown 수준은 RT-qPCR에 의해 검증한다. 또한 최종 cell line 제품을 출고하기 위해 멸균 테스트 및 mycoplasma 검출과 같은 일련의 표준 QC 분석이 수행된다.

Price and turnaround of stable cell line generation servicesView more
Stable Cell Line Model Strategy Deliverable Price (USD) Turnaround
shRNA Gene Knockdown Lentivirus-based Pooled Cells From $6,646 8-13 weeks
3 Single Clones From $8,645 11-18 weeks

Technical Information

shRNA-mediated gene knockdown

Short hairpin RNA (shRNAs)는 상보적 염기쌍을 통해 mRNA 서열의 타겟 분해에 사용할 수 있는 stem-loop 구조를 가진 RNA 분자로 다양한 RNAi 응용 분야에 널리 사용된다. shRNA는 바이러스 및 비바이러스 형태 모두에서 이중 가닥 DNA 벡터를 사용하여 타겟 세포에 도입될 수 있다. 세포가 shRNA 벡터로 transfection되거나 transduction될 때 shRNA는 핵에서 전사되어 침묵할 mRNA와 동일한 서열을 갖는 sense 가닥으로 구성된 hairpin 구조를 형성하고, 이어서 단일 가닥 loop와 sense 가닥과 상보적인 antisense 가닥으로 구성된다. 전사된 shRNA는 핵을 빠져 나와 세포질에서 Dicer에 의해 처리된 다음 후속 타겟 mRNA 인식 및 분해를 위해 RNA-induced silencing complex (RISC) complex에 실린다 (Figure 1).

Figure 1 . Mechanisms of U6-based and miR-based shRNA mediated gene expression knockdown.

shRNA 매개 유전자 발현의 knockdown은 기존의 합성 small interfering RNAs (siRNAs)를 사용하는 유전자 발현 knockdown에 비해 몇가지 장점을 제공하므로 대부분의 RNAi 응용 분야에서 선호되는 knockdown 방법으로 인기를 얻고 있다.

아래 표는 siRNA 매개 유전자 knockdown에 비해 shRNA 매개 유전자 knockdown의 장점을 요약한 것이다.

shRNA-Mediated Knockdown siRNA-Mediated Knockdown
Delivery method Transfection or transduction depending on vector type Transfection
Knockdown duration Long-term Transient
Episomal or stable integration Can be either episomal or stable depending upon delivery method Episomal
Ability to add selection markers Yes, fluorescent or drug-selection markers can be added No
Cell-type range Suitable for a wide range of cell types Suitable for only cells with high transfection efficiency
Off-target effects Reduced off-target effects High off-target effects
Degradation rate Low High
Controlling shRNA expression

벡터에서 shRNA 발현을 제어하기 위해 널리 사용되는 두가지 방법이 있다 : U6-based shRNA 발현 및 miR-based shRNA 발현. U6-based shRNA 벡터가 U6과 같은 RNA Polymerase III promoter에 의해 전사된 간단한 stem-loop shRNA의 발현을 유도하는 반면, miR-based shRNA 벡터는 RNA Polymerase II promoter 아래에서 microRNA scaffold로 개조된 shRNA를 발현하는데 사용된다. U6 및 miR-based 벡터 시스템에 의해 발현되는 shRNA는 세포질 내에서 유사한 메커니즘에 의해 처리되어 궁극적으로 타겟 gene silencing을 유도한다. 그러나 U6-based shRNA와 달리 miR-based shRNA는 핵 내에서 전사된 후 구조 내에 내인성 miR-based 서열이 존재하기 때문에 primary miRNA와 유사한 메커니즘으로 처리된다 (Figure 1). 

miR-based shRNA 벡터에 RNA polymerase II promoter가 있으면 조직 특이적, 유도성 또는 다양한 강도의 promoter를 사용할 수 있으므로 필수 구성요소인 U6 promoter로는 가능하지 않은 다양한 실험에 적용할 수 있다. miRNA-based shRNA 시스템에서 긴 전사체를 효율적으로 전사하는 RNA polymerase II promoter의 능력은 다른 knockdown 벡터 시스템에 비해 몇가지 추가 이점을 제공한다. 여러 shRNAmiR은 단일 polycistron으로 전사될 수 있으며, 이는 세포 내에서 mature shRNA를 형성하도록 처리된다. 이를 통해 단일 전사체를 사용하여 여러 유전자를 knockdown하거나 동일한 유전자 내의 여러 영역을 타겟팅할 수 있다. 결과적으로 이 벡터는 단일 또는 다중 shRNAmiR을 발현하는 데 사용할 수 있다. 둘째, 이 벡터 시스템에서 사용자가 선택한 단백질 코딩 유전자는 shRNAmiR과 동일한 polycistron 내에 위치할 수 있다. 이 ORF의 발현은 shRNA 전사 (마커 ORF가 사용되는 경우)를 직접 모니터링하는데 사용되거나 ORF 및 shRNA의 공동 발현이 필요한 다른 목적으로 사용될 수 있다.

miR 기반 벡터를 사용하여 shRNA 발현을 제어하는 ​​유연성에도 불구하고, 종종 miR-based 벡터보다 U6-based벡터를 사용하여 더 강력한 shRNA 매개 유전자 knockdown을 관찰했다. 따라서 miR-based shRNA 벡터를 사용할 필요가 없는 한 일반적으로 유전자 knockdown 실험에 U6-based shRNA 벡터를 사용하는 것이 좋다.

아래 표는 U6-based shRNA 벡터 시스템과 miR-based shRNA 벡터 시스템을 비교한 것이다.

U6-Based shRNA Vector miR-Based shRNA Vector
shRNA structure Simple stem-loop shRNA shRNA adapted with a microRNA scaffold
shRNA length 50-70 nt >250 nt
Promoter RNA Pol III promoters such as U6 and H1 RNA Pol II promoters including ubiquitous, tissue-specific and inducible promoters
shRNA processing mechanism Processed by only Dicer in the cytoplasm Processed by Drosha in the nucleus and Dicer in the cytoplasm
No. of shRNAs that can be expressed on one vector Single shRNA (usually) Single or multiple shRNAs
Ability to express other ORFs in the shRNA transcript No Yes
Gene knockdown efficiency Often more robust Often less robust
Toxicity High cellular toxicity Decreased cellular toxicity
shRNA databases

VectorBuilder의 온라인 shRNA 벡터 디자인 툴은 일반적인 종에 최적화된 shRNA 데이터베이스를 제공하므로 타겟 유전자에 대한 높은 knockdown 효율로 shRNA 벡터를 디자인할 수 있다. shRNA를 디자인하기 위해 RNAi consortium에서 사용하는 것과 동일한 규칙을 적용한다. 모든 스코어는 ≥0, 평균은 ~ 5, 표준 편차는 ~ 5, 스코어의 95 %는 ≤15입니다. Knockdown 스코어가 약 15인 shRNA는 최고의 knockdown 성능과 clonability를 가진 것으로 간주되는 반면, knockdown 스코어가 0인 shRNA는 최악의 knockdown 성능을 갖거나 클로닝하기 어렵다.

VectorBuilder의 온라인 플랫폼에서 shRNA 벡터를 디자인할 때 데이터베이스에서 타겟 유전자를 검색할 수 있는 옵션이 있다. 유전자 이름을 입력하면 데이터베이스에서 사용 가능한 대상 유전자에 대한 모든 shRNA에 대한 자세한 정보를 볼 수 있다. 여기에는 UCSC Genome Browser에 대한 링크가 포함되어 있어 이러한 shRNA를 게놈 서열 및 모든 전사체 isoform의 맥락에서 볼 수 있다. 당사의 데이터베이스는 감소하는 knockdown 스코어 순서로 타겟 유전자에 대해 사용 가능한 모든 shRNA의 순위를 매기고 knockdown 스코어가 가장 높은 상위 3개의 shRNA를 테스트할 것을 권장한다. 최저 스코어는 대략적인 기준일 뿐이다. 실제 knockdown 효율성은 스코어가 예측하는 것과 크게 다를 수 있다. 스코어가 낮은 대상 사이트는 여전히 잘 작동할 수 있다. 또한 3’UTR을 타겟팅하는 것은 코딩 지역을 타겟팅하는 것만큼 효과적일 수 있다.

VectorBuilder의 온라인 "리소스"에는 shRNA-based RNAi 실험을 성공적으로 계획, 실행 및 문제 해결하는데 도움이 되는 풍부한 학습 자료가 포함되어 있다.

Click to read guides on shRNA vector systems
Click to read guides on various vector components for customizing your shRNA vectors
References

Mol Cell. 9:1327 (2002); Characterization of miR30-based gene knockdown.

Nucleic Acids Res. 34:e53 (2006); Development of miR155-based shRNA vectors.

J Gene Med. 9:620 (2007); Development of IPTG-inducible gene knockdown system.

Proc Natl Acad Sci USA. 101:10380 (2004); Development of Cre-lox-regulated gene knockdown system.

FAQ

What are the pros and cons of shRNA-mediated knockdown versus CRISPR- or TALEN-mediated knockout?

Either shRNA-mediated knockdown or nuclease-mediated knockout (e.g. CRISPR or TALEN) can be valuable experimental approach to study the loss-of-function effects of a gene of interest in cell culture. In order to decide which method is optimal for your specific application, there are a few things you should consider.

Mechanisms

  • Knockdown vectors: knockdown vectors express short hairpin RNAs (shRNAs) that repress the function of target mRNAs within the cell by inducing their cleavage and repressing their translation. Therefore, shRNA knockdown vectors are not associated with any DNA level sequence change of the gene of interest.
  • Knockout vectors: CRISPR and TALEN both function by directing nucleases to cut specific target sites in the genome. These cuts are then inefficiently repaired by the cellular machinery, resulting in permanent mutations, such as small insertions or deletions, at the sites of repair. A subset of these mutations will result in loss of function of the gene of interest due to frame-shifts, premature stop codons, etc. If two closely positioned cut sites in the genome (i.e. within several kb) are targeted simultaneously, this can also result in the deletion of the intervening region.

Effectiveness

shRNA-mediated knockdown will never completely repress the expression of the target gene. Even for the most effective shRNAs, some residual expression of the target gene will remain. In contrast, in a fraction of treated cells, CRISPR and TALEN can generate permanent mutations which may result in complete loss of gene function.

Consistency and uniformity

shRNA vectors generally provide high cell-to-cell uniformity within the pool of treated cells and very consistent results between experiments. In contrast, CRISPR and TALEN produce results that are highly non-uniform from cell to cell due to the stochastic nature of the mutations introduced. To fully knock out the gene of interest in a cell, all copies of the gene in the cell must be knocked out. Given that normal cells have two copies of any gene (except for X- or Y-linked genes) while cancer cells can have more than two copies, such full knockout cells may represent a very small fraction of all the treated cells. For this reason, nuclease-mediated knockout experiments require the screening of clones by sequencing to identify the subset in which all copies of the gene of interest have been knocked out.

Off-target effects

Off-target effects have been reported for both shRNA-mediated knockdown and nuclease-mediated knockout. The off-target phenotype(s) can be estimated by using multiple different shRNAs to target the same gene. If a gene knocked down by multiple different shRNAs results in consistent phenotype(s), then it argues against the phenotype(s) being caused by off-target effects. For CRISPR- or TALEN-mediated knockout, multiple clones containing loss-of-function mutations should be analyzed in order to account for any phenotype(s) that may be due to off-target mutations. Additionally, bioinformatically identified off-target sites could be sequenced in the clones to see if they have been mutated.

Design your homologous recombination donor vector online
Why isn’t my shRNA knocking down my gene of interest?

Not all shRNAs will work

Based on our experience and feedback from our customers, we know that generally when 3 or 4 shRNAs are tested for any arbitrary gene, typically 2 or 3 produce reasonable to good knockdown. However, when using shRNAs, it is important to recognize the fact that not all shRNAs will work. Typically, ~50-70% of shRNAs have noticeable knockdown effect, and ~20-30% of them have strong knockdown. If you try a few shRNAs targeting a specific gene, it is possible that by chance, none will produce satisfactory knockdown. When this happens, the best approach is to try more shRNAs, especially the ones that have literature validation. Many researchers also use a “cocktail” of shRNAs (i.e. mixture of different shRNAs) targeting the same gene, which sometimes can improve knockdown efficiency.

The assay for validating the knockdown of your gene is not performed properly

The most common and sensitive assay to evaluate shRNA knockdown efficiency is RT-qPCR. Sometimes, you may need to try several pairs of primers, and then choose the most specific and efficient pair to use. In general, the RT-qPCR primers should span exon-exon junction if possible to avoid amplifying genomic DNA. When using a new pair of primers, we recommend that you run the PCR product on an agarose gel to verify the band, or even validate the PCR product by sequencing. You should always include minus-RT control in RT-qPCR to better estimate the level of genomic DNA contamination. You can use NCBI primer designing tool to help you better examine the quality of your primers in silico.

Knockdown efficiency can also be assessed by Western blot. However, Western blot is notoriously prone to false positive bands from non-specific antibody binding, which could mistakenly lead to the interpretation that there is no knockdown. Care must therefore be taken to make sure that the antibody used is indeed specific to the gene of interest.

The shRNA might only target a subset of transcript isoforms of your gene

When designing shRNA, we generally recommend those that can target as many transcript isoforms of the gene as possible, unless you are only interested in knocking down a particular isoform. VectorBuilder has created shRNA databases that contain optimized shRNAs for common species. If you design shRNA vectors on VectorBuilder, when you insert the shRNA component into the vector, you will have the option to search the target gene in our database. Then, you will see the detailed information of all the available shRNAs we designed for you, including a link to UCSC Genome Browser to view these shRNAs in the context of genomic sequence and all the transcript isoforms.

How is shRNA knockdown score calculated?

VectorBuilder applies rules similar to that used by the RNAi consortium (TRC) to design and score shRNAs. For each given RefSeq transcript, we search for all possible 21mers that are considered as candidate target sites. Candidates are excluded if they contain features thought to reduce knockdown efficiency/specificity or cloneability, including a run of ≥4 of the same base, a run of ≥7 G or C, GC content <25% or >60%, and AA at the 5’ end. Knockdown scores are penalized for candidates that contain internal stem-loop, high GC content toward the 3’ end, known miRNA seed sequences, or off-target matches to other genes. For genes with alternative transcripts, target sites that exist in all transcripts are given higher scores.

All scores are ≥0, with mean at ~5, standard deviation at ~5, and 95% of scores ≤15. An shRNA with a knockdown score about 15 is considered to have the best knockdown performance and cloneability, while an shRNA with a knockdown score of 0 has the worst knockdown performance or is hard to be cloned.

Please note that knockdown scores are only a rough guide. Actual knockdown efficiency could depart significantly from what the scores predict. Target sites with low scores may still work well. Also, please note that targeting 3’ UTR can be as effective as targeting coding region.