shRNA 유전자 발현 억제 솔루션shRNA Gene Knockdown Solutions

VectorBuilder는 RNAi 실험에 이상적인 도구를 제공하기 위한 포괄적인 shRNA 시약 컬렉션을 제공합니다. 실험에서 요구되는 바에 따라 다양한 방식으로 shRNA 발현을 조절할 수 있는 유연성을 제공하기 위해 U6 및 miR30에 기반한 shRNA 시스템을 모두 제공합니다. shRNA를 transfection이 어려운 세포에 전달하기 위해 주요 바이러스 유형 (예: 렌티바이러스, AAV, 아데노바이러스) 으로 다양한 titer 스케일로 패키징할 수 있습니다. 또한 포유류 세포에서 대규모의 loss-of-function screening을 위한 pooled shRNA library를 전문적으로 제작할 수 있습니다. 아울러 온라인 벡터 디자인 플랫폼은 많이 사용되는 종들에 대한 shRNA 데이터베이스와 통합되어 목적 유전자 (GOI)를 타겟팅하는데 적합한 shRNA를 쉽게 선택할 수 있습니다다.
서비스 중점 사항
  • shRNA 벡터의 빠르고 쉬운 디자인를 위한 전체 유전체의 shRNA 데이터베이스가 통합된 매우 직관적인 온라인 디자인 플랫폼
  • 벡터 backbone 및 벡터 컴포넌트의 풍부한 컬렉션
  • Premade 및 맞춤 제작 shRNA library 보유
  • 100% 서열 검증, 짧은 소요시간 및 경쟁력 있는 가격
  • shRNA 선택, 벡터 디자인 및 문제 해결을 위한 강력한 기술 지원
서비스 세부 사항
  • 맞춤형 shRNA 벡터
  • 자주 사용되는 shRNA 벡터
  • shRNA 바이러스
  • shRNA (3+1) 바이러스 패키징
  • Pooled shRNA library
  • 안정한 shRNA knockdown 세포주 제작
기술적인 정보
  • shRNA에 의한 유전자 knockdown
  • shRNA 발현 조절
  • 실험적 검증
  • shRNA 데이터베이스

서비스 세부 사항

맞춤형 shRNA 벡터

매우 직관적인 온라인 벡터 디자인 플랫폼을 사용하여 shRNA 발현을 위한 30개 이상의 벡터 backbone (non-viral, viral 또는 transposon)과 벡터 구성 요소들 (promoters, fluorescent 및 항생제 선별marker)의 수많은 조합 중에서 선택할 수 있습니다. 당사의 shRNA 데이터베이스를 이용하면 직접 디자인할 필요 없이 GOI에 대한 shRNA들을 쉽게 선택할 수 있습니다. 또한 원하시는 shRNA의 knockdown 효율을 테스트하기 위한 shRNA sensor 벡터도 제공합니다.

Plasmid DNA 정제 및 바이러스 패키징은 shRNA 벡터 디자인 완료시 downstream 서비스로 구매할 수 있습니다.

맞춤형 shRNA 벡터 선택하기 View more

위에 열거된 벡터 시스템 이외에도 IPTG에 의하여 유도되는 shRNA 발현 벡터와 Cre-lox 에 의해 조건부로 발현되는 shRNA 발현 벡터도 디자인하고 제작해드릴 수 있습니다. 디자인 의뢰하기를 통하여 문의하여 주시기 바랍니다.

벡터 제작 서비스에 대한 자세한 내용을 보시려면 여기를 눌러주시기 바랍니다.
자주 사용되는 shRNA 벡터

VectorBuilder는 많은 생물학 응용 분야에서 control 벡터로 사용하기에 적합한 scramble shRNA 또는 특정한 유전자를 타겟으로 하는 shRNA를 발현하는 shRNA 벡터 패널을 제공합니다. Plasmid DNA 정제 및 바이러스 패키징은 이러한 벡터를 shopping cart에 추가할 때 downstream 서비스로 구입할 수 있습니다.

아래의 벡터 picker를 사용하여 U6 기반의 shRNA 벡터를 주문할 수 있습니다.

miR30 기반의 shRNA 벡터를 주문하려면, 원하시는 사항을 디자인 의뢰하기로 보내주시면 됩니다..

shRNA 바이러스

VectorBuilder는 shRNA를 transfection이 어려운 세포에 전달하기 위한 다양한 스케일과 우수한 품질의 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스에 대한 바이러스 패키징 서비스를 제공합니다. 당사는 자체의 기술과 시약들을 개발하여 titer, 순도, 생존력 및 일관성 측면에서 바이러스 패키징 과정을 크게 개선하였습니다. 당사의 패키징 방법은 벡터 제작 서비스에 사용되는 바이러스 벡터 시스템을 위해서도 최적화되어 있습니다. 그 결과 벡터 클로닝과 패키징에 대한 고객의 요구를 만족시킬 수 있는 서비스를 제공함으로써 당사에 반복적으로 제작을 의뢰하는 고객들이 점점 많아지고 있습니다.

렌티바이러스 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일 View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >4x108 TU/ml >108 TU/ml 250 ul (10x25 ul) $399 8-16 days
Medium >3x108 TU/ml 1 ml (10x100 ul) $599
Large >2x109 TU/ml >109 TU/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x109 TU/ml >109 TU/ml 500 ul (10x50 ul) $1,299
Ultra-purified large 1 ml (10x 100 ul) $1,599

TU = Transduction units (also known as infectious units)

AAV 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >1012 GC/ml >2x1011 GC/ml 250 ul (10x25 ul) $399 10-18 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $599
Large >5x1012 GC/ml >2x1012 GC/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo >2x1013 GC/ml >1013 GC/ml 100 ul (4x25 ul) $1,299 16-26 days
Ultra-purified medium 500 ul (10x50 ul) $1,899
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,999

GC = Genome copies

아데노바이러스 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일 View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >2x1010 IFU/ml >1010 IFU/ml 250 ul (10x25 ul) $599 27-39 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $999
Large >2x1011 IFU/ml >1011 IFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,599
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x1012 VP/ml >1012 VP/ml 500 ul (10x50 ul) $1,999 29-43 days
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,399

IFU = Infectious units; VP = Virus particles

바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 내용을 보시려면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

shRNA (3+1) 바이러스 패키징

경험적으로 디자인된 모든 shRNA가 원하는 대로 작동하는 것은 아니라는 사실을 인식하는 것이 중요합니다. shRNA의 효능은 shRNA의 길이, loop 구조, GC profile 및 열역학적 안정성, 타겟 서열의 2차 구조, 다른 유전자와의 off-target 매치를 포함한 여러 요인에 의해 결정됩니다. 일반적으로 shRNA의 50-70%는 knockdown 효과를 나타내며, 그 중 20-30%는 강한 knockdown 효과를 갖습니다. 따라서 downstream 실험을 위한 가장 강력한 shRNA를 찾기 위해서는 여러 shRNA를 테스트하는 것이 중요합니다.

VectorBuilder는 GOI를 타겟으로 하는 3개의 custom shRNA 바이러스와 1개의 scramble control 바이러스를 포함하는 shRNA (3 + 1) 바이러스 패키징 서비스를 제공하며, 이를 이용하여 매우 경제적으로 하나의 타겟 유전자에 대한 여러 개의 shRNA를 테스트할 수 있습니다. 이 서비스는 현재 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스로 제공됩니다.

shRNA (3+1) 바이러스 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일 View more
Virus Type Scale & Deliverable  Application Price (USD)* Turnaround**
Lentivirus Pilot Cell culture $1,248 15-28 days
Medium $1,748
Large $2,748
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo $3,948
Ultra-purified large $4,748
AAV Pilot Cell culture $1,248 17-30 days
Medium $1,748
Large $2,748
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo $4,148 23-38 days
Ultra-purified medium $5,648
Ultra-purified large $8,748
Adenovirus Pilot Cell culture $2,148 39-57 days
Medium $3,148
Large $4,348
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo $6,148 41-51 days
Ultra-purified large $7,448

* 가격은 벡터 제작과 바이러스 패키징을 포함합니다..

** 소요 시간은 벡터 제작과 바이러스 패키징을 포함한 시간입니다.

타겟 유전자를 위한 shRNA (3+1)  바이러스 패키징을 주문하시려면 아래의 ordering tool을 이용해주시기 바랍니다.

위의 벡터 picker는 U6 기반의 shRNA 벡터에만 적용됩니다. miR30 기반의 shRNA 벡터를 원하시거나, 벡터 picker에서 원하시는 유전자에 대한 shRNA를 찾을 수 없는 경우에는 원하시는 사항을 디자인 의뢰하기로 보내주시면 됩니다.

혼합 shRNA library

혼합 shRNA library는 질병의 경로, 약물 처리에 대한 세포의 반응, 발생 과정, 유전자 조절 등에 관련된 유전자를 찾기 위한 대규모의 loss-of-function screening을 수행하기 위한 강력하고 비용 효율적인 도구로 사용될 수 있습니다. 필요에 따라 E. coli stock, plasmid DNA pool 또는 패키징된 바이러스 형태로 library를 제공할 수 있습니다. 당사의 맞춤형 library는 NGS를 통해 충분히 검증되었기 때문에, 믿고 사용하실 수 있습니다.

맞춤형 혼합 shRNA library 제작 이외에도 VectorBuilder는 인간 및 마우스 유전자를 대상으로 하는 고품질의 premade 혼합 shRNA library를 제공합니다. 각 종에 대해 바로 사용할 수 있는 렌티바이러스 library를 2가지 스케일로 제공합니다: Whole Genome (~ 19,000 RefSeq 유전자들) 및 Elite Gene (~2,000 PubMed Central에서 가장 자주 인용되는 유전자들). 가능한 경우 각 유전자는 5-6개의 서로 다른 shRNA에 의해 타겟팅됩니다. 이들 library는 NGS 및 기능적인 분석을 통해 완전히 검증되었습니다.

Premade shRNA library의 중점 사항:

  • 전체 유전체를 대상으로 하며, 타겟 유전자들에 대한 높은 coverage를 갖추고 있음
  • NGS에 의한 library 품질 검증
  • 높은 균일성
  • 높은 titer의 렌티바이러스로 바로 사용 가능함
  • EGFP/Puro 이중 marker를 사용하여 transduction된 세포를 효율적이며 다양한 방법으로 선별하거나 추적할 수 있음
Premade shRNA library의 가격 및 소요 시간View more
Product Name No. of genes No. of shRNAs Scale* Catalog No. Price (USD)
Human Elite Gene Pooled shRNA Library 2,161 12,471 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1037bjk) $4,999
$2,499
Mouse Elite Gene Pooled shRNA Library 2,233 12,472 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1039sgb) $4,999
$2,499
Human Whole Genome Pooled shRNA Library 18,432 92,917 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1038ngq) $4,999
$2,499
Plus
(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)
LV5M(Lib190505-1038ngq) $14,999
$7,499
Mouse Whole Genome Pooled shRNA Library 19,790 92,917 Medium
(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)
LVM(Lib190505-1042tfx) $4,999
$2,499
Plus
(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)
LV5M(Lib190505-1042tfx) $14,999
$7,499

* Elite Gene library의 경우, medium scale은 100x shRNA coverage로 40회 이상의 screening을 하기에 충분합니다. Whole Genome library의 경우, medium scale은 100x shRNA coverage로 5회 이상 screening을 하기에 충분하며, plus scale은 100x shRNA coverage로 25회 이상의 screening을 하기에 충분한 양입니다.

안정한 shRNA knockdown 세포주

VectorBuilder는 GOI의 장기간 knockdown이 필요한 응용 분야를 위해 안정한 shRNA knockdown 세포주를 맞춤형으로 제작할 수 있습니다. GOI의 효율적인 knockdown을 보장하기 위해 knockdown score에 따라 상위 3개의 후보 shRNA들을 테스트하여, 최고의 knockdown 효율을 가진 shRNA가 렌티바이러스 transduction에 의한 안정한 세포주를 제작하는데 사용됩니다. 세포주의 knockdown 수준은 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 또한 최종 세포주 제품을 출고하기 위해 무균 테스트 및 mycoplasma 검출과 같은 일련의 표준 QC 분석이 수행됩니다.

안정한 세포주 제작 서비스의 가격 및 소요 시간View more
Stable Cell Line Model Strategy Deliverable Price (USD) Turnaround
shRNA Gene Knockdown Lentivirus-based Pooled Cells From $6,646 8-13 weeks
3 Single Clones From $8,645 11-18 weeks

기술적인 정보

shRNA에 의한 유전자 knockdown

Short hairpin RNA (shRNAs)는 상보적 염기쌍을 통해 특정한 mRNA 서열을 타겟으로 하여 분해하는데 사용할 수 있는 stem-loop 구조를 가진 RNA 분자로 다양한 RNAi 응용 분야에 널리 사용됩니다. shRNA는 바이러스 및 바이러스가 아닌 형식으로 double strand DNA 벡터를 사용하여 타겟 세포에 도입될 수 있습니다. 세포가 shRNA 벡터로 transfection되거나 transduction될 때, shRNA는 핵에서 전사되어 타겟 mRNA와 동일한 서열을 갖는 sense strand, single strand loop, sense strand와 상보적인 antisense strand로 구성된 hairpin 구조를 형성합니다. 전사된 shRNA는 핵을 빠져 나와 세포질에서 Dicer에 의해 처리되어 mature shRNA가 되고, RNA-induced silencing complex (RISC) 에 결합하여 타겟 mRNA의 인식 및 분해를 위해 이용됩니다 (Figure 1).

Figure 1 . U6 기반 및 miR 기반의 shRNA에 의한 유전자 발현 knockdown 매커니즘.

shRNA에 의한 유전자 발현 knockdown은 기존의 합성에 의한 small interfering RNA (siRNA)를 사용하는 유전자 발현 knockdown에 비해 여러 가지 장점을 제공하므로, 대부분의 RNAi 응용 분야에서 선호되는 knockdown 방법이 되고 있습니다.

아래 표는 siRNA에 의한 유전자 knockdown과 비교할 때의 shRNA에 의한 유전자 knockdown의 장점들을 요약한 것입니다.

shRNA-Mediated Knockdown siRNA-Mediated Knockdown
Delivery method Transfection or transduction depending on vector type Transfection
Knockdown duration Long-term Transient
Episomal or stable integration Can be either episomal or stable depending upon delivery method Episomal
Ability to add selection markers Yes, fluorescent or drug-selection markers can be added No
Cell-type range Suitable for a wide range of cell types Suitable for only cells with high transfection efficiency
Off-target effects Reduced off-target effects High off-target effects
Degradation rate Low High
shRNA 발현 조절

벡터에서 shRNA 발현을 조절하기 위해서 널리 사용되는 방법으로 U6에 의한 발현과 miR에 의한 발현의 두가지 방법이 있습니다. U6 기반의 shRNA 벡터가 U6와 같은 RNA Polymerase III promoter에 의해 전사되는 단순한 stem-loop shRNA의 발현을 유도하는 반면에, miR 기반의 shRNA 벡터는 RNA Polymerase II promoter에 의해서 microRNA scaffold로 shRNA를 발현하는데 사용됩니다. U6 및 miR 기반의 벡터 시스템에 의해 발현되는 shRNA는 세포질 내에서 유사한 메커니즘에 의해 처리되어 최종적으로 타겟 유전자의 silencing을 유도합니다. 그러나 U6 기반의 shRNA와 달리 miR 기반의 shRNA는 핵 내에서 전사된 후 구조에 내재된 miR 서열이 존재하기 때문에 primary miRNA와 유사한 메커니즘으로 처리됩니다 (Figure 1). 

miR 기반 shRNA 벡터의 RNA polymerase II promoter로는 조직 특이적 발현, 유도 발현 또는 다양한 강도의 promoter들을 사용할 수 있게 하며, 이는 지속적으로 발현되는 U6 promoter에 의해서는 가능하지 않은 일입니다. miRNA 기반의 shRNA 시스템에서 긴 전사체를 효율적으로 전사하는 RNA polymerase II promoter의 능력은 다른 knockdown 벡터 시스템에 비해 몇가지 추가 이점을 제공합니다. 첫째, 여러 shRNAmiR들을 하나의 polycistron으로 전사할 수 있으며, 하나의 전사체가 세포 내에서 처리되어 여러 개의 mature shRNA들을 형성할 수 있습니다. 이를 통해 단일 전사체를 사용하여 여러 유전자를 knockdown하거나 동일한 유전자 내의 여러 영역을 타겟팅할 수 있어서, 결과적으로 이 벡터는 단일 또는 다중 shRNAmiR를 발현하는데 사용될 수 있습니다. 둘째, 이 벡터 시스템에서 사용자가 선택한 단백질을 코딩하는 유전자를 shRNAmiR와 동일한 polycistron 내에 위치하도록 할 수 있습니다. 이 ORF의 발현은 shRNA 전사 (마커 ORF가 사용되는 경우)를 직접적으로 모니터링하는데 사용되거나 ORF 및 shRNA의 동시 발현이 필요한 다른 목적으로 사용될 수 있습니다.

miR 기반의 벡터를 사용한 shRNA 발현에 의해 제공되는 ​​유연성에도 불구하고, 종종 miR 기반의 벡터보다 U6 기반의 벡터를 사용할 때 더 강력한 shRNA에 의한 유전자 knockdown을 볼 수 있습니다. 따라서 miR 기반의 shRNA 벡터를 특별히 사용해야 할 필요성이 없으면, 일반적인 유전자 knockdown 실험을 위해서는 U6 기반의 shRNA 벡터 사용을 권해 드립니다.

아래 표는 U6 기반 shRNA 벡터 시스템과 miR 기반 shRNA 벡터 시스템을 비교한 것입니다.

U6-Based shRNA Vector miR-Based shRNA Vector
shRNA structure Simple stem-loop shRNA shRNA adapted with a microRNA scaffold
shRNA length 50-70 nt >250 nt
Promoter RNA Pol III promoters such as U6 and H1 RNA Pol II promoters including ubiquitous, tissue-specific and inducible promoters
shRNA processing mechanism Processed by only Dicer in the cytoplasm Processed by Drosha in the nucleus and Dicer in the cytoplasm
No. of shRNAs that can be expressed on one vector Single shRNA (usually) Single or multiple shRNAs
Ability to express other ORFs in the shRNA transcript No Yes
Gene knockdown efficiency Often more robust Often less robust
Toxicity High cellular toxicity Decreased cellular toxicity
실험적 검증

VectorBuilder의 lentivirus U6-based shRNA knockdown 벡터는 아래 Figure 2와 같이 고효율 유전자 knockdown이 검증되었습니다. U6-based 및 miR30-based shRNA 시스템 간의 비교도 제시 되었습니다..

Figure 2. U6-based와 miR30-based shRNA 렌티바이러스 시스템을 통한 EGFP knockdown 비교. (A) U6 구동 shRNA, CMV 구동 miR30-based single shRNA 및 CMV 구동 miR30-based quad shRNA를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 각각 렌티바이러스 입자로 패키징하였습니다. EGFP를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포에 shRNA 렌티바이러스를 형질도입하고, 적절한 항생제를 사용하여 약물 선택 전후에 flow cytometry를 통해 EGFP 발현을 측정하였습니다. (B) 약물 선택 전, EGFP 발현은 U6-based shRNA를 통해 ~46%(P<0.001), CMV 기반 miR30-based single shRNA를 통해 13%(P<0.001), CMV 구동 miR30-based quad shRNA를 통해 44%(P <0.001) 감소 되었습니다. (C) 약물 선택 후 EGFP 발현은 U6-based shRNA를 통해 ~72%(P<0.001), CMV 기반 miR30-based single shRNA를 통해 60%(P<0.001), CMV 구동 miR30-based quad shRNA를 통해 67%(P <0.001) 감소 되었습니다. 상대적 EGFP 발현은 형질도입된 세포의 median fluorescence intensities (MFI)를 형질도입되지 않은 세포의 MFI로 나누어 계산하였습니다. 3회 반복 실험을 수행하였고, SD는 그림에 표시되었습니다. p-value는 Tukey’s test를 기반으로 계산되었습니다.

shRNA 데이터베이스

VectorBuilder의 온라인 shRNA 벡터 디자인 툴은 일반적으로 많이 이용되는 종들에 최적화된 shRNA 데이터베이스를 제공하므로, 타겟 유전자에 대해 높은 knockdown 효율을 나타내는 shRNA 벡터를 디자인할 수 있게 합니다. shRNA를 디자인하기 위해 RNAi consortium에서 사용하는 것과 유사한 규칙을 적용합니다. 모든 score는 0 이상으로, 평균 5, 표준편차 5 정도의 분포를 나타내며, 95%의 score가 15 이하입니다. Knockdown score가 15 정도인 shRNA들은 최상의 knockdown performance와 클로닝 가능성을 가진 것으로 간주되며, knockdown score가 0 인 경우 최악의 knockdown performance를 가지거나 클로닝이 어려운 shRNA로 간주됩니다.

VectorBuilder의 온라인 플랫폼에서 shRNA 벡터를 디자인할 때 데이터베이스에서 타겟 유전자로 검색할 수 있는 옵션이 있습니다. 유전자 이름을 입력하면 데이터베이스에서 대상 유전자에 대한 모든 shRNA의 자세한 정보를 볼 수 있습니다. 여기에는 UCSC Genome Browser에 대한 링크가 포함되어 있어 이러한 shRNA를 유전체 서열 및 모든 전사체 isoform 상에서 볼 수 있습니다. 당사의 데이터베이스는 knockdown score가 감소하는 순서로 타겟 유전자에 대한 모든 shRNA의 순위를 보여 주며, knockdown score가 가장 높은 상위 3개의 shRNA를 테스트할 것을 권장합니다. Knockdown score는 대략적인 가이드에 불과하다는 점에 유의해주시기 바랍니다. 실제 knockdown 효율은 score로 예상되는 것과 큰 차이가 있을 수 있습니다. Score가 낮은 타겟 부위도 실제로는 knockdown을 잘 할 가능성이 있습니다. 타겟 유전자의 3’ UTR도 코딩 부위와 마찬가지로 효과가 있을 수 있습니다.

VectorBuilder의 온라인 "정보 자료" 메뉴에는 shRNA에 의한 RNAi 실험을 성공적으로 계획, 실행 및 문제 해결하는데 도움이 될 수 있는 풍부한 참고 자료가 포함되어 있습니다.

shRNA 벡터 시스템에 대한 가이드를 보시려면 여기를 눌러주시기 바랍니다.
맞춤형 shRNA 벡터 디자인을 위한 다양한 벡터 구성 요소들에 대한 가이드를 보시려면 여기를 눌러주시기 바랍니다.
인용 논문

Mol Cell. 9:1327 (2002); Characterization of miR30-based gene knockdown.

Nucleic Acids Res. 34:e53 (2006); Development of miR155-based shRNA vectors.

J Gene Med. 9:620 (2007); Development of IPTG-inducible gene knockdown system.

Proc Natl Acad Sci USA. 101:10380 (2004); Development of Cre-lox-regulated gene knockdown system.

자주 묻는 질문

shRNA knockdown과 CRISPR knockout의 장단점은 어떠합니까?

shRNA에 의한 knockdown과 nuclease (CRISPR 또는 TALEN) 에 의한 knockout 모두 세포 배양을 통해서 원하는 유전자의 loss-of-function 효과를 연구하기 위한 중요한 방법들입니다. 연구 목적을 위하여 어떤 방법이 가장 적절한지를 결정하기 위해서는 몇 가지 고려해야 할 사항들이 있습니다.

매커니즘

  • Knockdown 벡터: Knockdown 벡터는 세포 내에서 타겟 RNA의 절단을 유발하고 translation을 억제함으로써 타겟 RNA의 활성을 억제하는 short hairpin RNA (shRNA) 를 발현합니다. 따라서, shRNA knockdown 벡터는 원하는 유전자에 어떠한 DNA 수준의 서열 변화도 일으키지 않습니다.
  • Knockout 벡터: CRISPR와 TALEN 둘 다 유전체 내의 특정한 타겟 부위를 절단하기 위하여 nuclease를 타겟 부위에 유도함으로써 작용합니다. 이러한 절단 부위는 세포내 기작에 의하여 비효율적으로 수리됨으로써, 그 부위에 짧은 서열이 삽입되거나 제거되면서 영구적인 변이가 생성되게 합니다. 이러한 변이 중 일부는 frame shift나 premature stop codon 등에 의하여 원하는 유전자의 loss-of-function이 일어나도록 합니다. 유전체 내에서 수 kb 이내의 가까운 거리에 위치하는 두 절단 부위가 동시에 타겟팅되는 경우, 그 사이의 서열이 제거되는 결과로 나타나기도 합니다.

효율

shRNA에 의한 knockdown으로는 절대로 타겟 유전자의 완전한 발현 억제가 되지 않습니다. 가장 효율적인 shRNA에 의해서도 어느 정도는 타겟 유전자의 발현이 유지됩니다. 반면에 CRISPR와 TALEN을 처리한 세포들의 경우, 일부의 세포들에서는 영구 변이를 통하여 원하는 유전자의 완전한 loss-of-function이 일어날 수 있습니다.

일관성 및 균일성

일반적으로 shRNA 벡터는 처리한 세포들 사이의 높은 균일성을 나타내며, 서로 다른 실험 결과에서도 일관된 결과를 보입니다. 반면에 CRISPR와 TALEN은 도입되는 변이의 무작위적인 특성에 의하여 처리한 세포들 사이의 높은 비균일성을 나타냅니다. 하나의 세포 내에서 원하는 유전자의 완전한 knockout을 위해서는 세포 내에 존재하는 해당 유전자의 모든 copy를 knockout해야 합니다. 정상 세포들은 X- 또는 Y-염색체에 있는 유전자들을 제외하고는 모두 2 copy씩 가지고 있으며, 암세포들은 2 copy 이상을 가질 수 있어서, 전체 세포들 중 매우 작은 부분만이 완전한 knockout이 일어난 세포들일 수 있습니다. 이러한 이유로, nuclease에 의한 knockout 실험에서는 원하는 유전자의 모든 copy들이 knockout된 subset을 확인하기 위하여 sequencing에 의하여 clone들을 screening해야 합니다..

Off-target 효과

Off-target 효과는 shRNA에 의한 knockdown과 nuclease에 의한 knockout 둘 다에서 보고되었습니다. Off-target의 표현형은 같은 유전자를 타겟팅하는 다른 여러 개의 shRNA를 사용함으로써 추정할 수 있습니다. 여러 개의 다른 shRNA에 의하여 일관되게 나타나는 knockdown 표현형이 있으면, 그 결과가 off-target 효과에 의한 것이 아니라고 할 수 있습니다. CRISPR와 TALEN에 의한 knockout에서는 off-target 변이에 의한 표현형을 설명하기 위해서는 여러 개의 loss-of-function을 초래하는 변이를 포함하는 clone들을 분석해야 합니다. 또한, bioinformatics에 의하여 발견한 잠재적인 off-target 부위들에 대한 변이 여부를 확인하기 위하여, sequencing으로 clone들을 확인하여야 합니다.

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원하는 유전자가 shRNA에 의하여 knockdown되지 않는 이유가 무엇입니까?

모든 shRNA가 예상처럼 효과를 나타내지는 않습니다.

당사의 경험과 고객의 피드백에 의하여, 임의의 유전자에 대한 3-4 개의 shRNA를 테스트하는 경우 일반적으로 2-3 개만이 적당하거나 좋은 효과를 나타내는 것을 알고 있습니다. 하지만, shRNA를 사용할 때는 모든 shRNA가 다 효과를 나타내는 것이 아니라는 점을 염두에 두는 것이 중요합니다. 일반적으로 50-70%의 shRNA가 눈에 띄는 효과를 나타내며, 그 중에서 23-30%가 강한 효과를 나타냅니다. 특정한 유전자를 타겟팅하는 몇 개의 shRNA를 사용할 경우, 그 중 하나도 만족스러운 knockdown 효과가 없을 수도 있습니다. 그럴 때 가장 좋은 방법은 문헌을 통하여 검증된 것을 포함하여 몇 가지 shRNA들을 추가로 테스트해보는 것입니다. 많은 연구자들이 서로 다른 shRNA들을 포함하는 “칵테일” 을 사용하기도 하며, 때때로 이에 의하여 knockdown 효율을 향상시킬 수 있음을 보여주고 있습니다.

유전자의 knockdown을 확인하기 위한 분석 방법이 적절하지 않습니다.

shRNA의 knockdown 효율을 평가하기 위한 가장 일반적이고 민감한 분석 방법은 RT-qPCR 입니다. 때때로 여러 쌍의 primer들 중에서 가장 높은 서열 특이성과 PCR 효율을 나타내는 것을 선택해야 할 수도 있습니다. 일반적으로 유전체 DNA를 증폭하는 것을 방지하기 위하여 가능하면 RT-qPCR primer들이 exon-exon junction에 걸쳐 있도록 해야 합니다. 새로운 primer 쌍을 사용할 때에는 PCR 결과물을 agarose gel에서 전기영동을 하여 band를 확인하거나, sequencing에 의하여 확인을 하는 것이 좋습니다. 유전체 DNA에 의한 오염을 더 잘 확인하기 위해서는 minus-RT control을 RT-qPCR을 할 때 포함시켜야 합니다. Primer의 품질을 더 잘 확인하려면 NCBI primer designing tool을 사용해보는 것도 도움이 될 것입니다.

Knockdown 효율은 Western blot에 의해서도 확인될 수 있습니다. 하지만, Western blot에 의하면 비특이적인 항체에 의하여 false positive band가 나타날 수 있음은 이미 잘 알려져 있으며, 이에 의하여 knockdown이 되지 않은 것으로 해석될 수도 있게 합니다. 따라서 사용하는 항체가 GOI에 의해 만들어지는 단백질에 정말로 특이적인 반응을 나타내는 것인지를 확인하는 것이 매우 중요합니다.

shRNA가 원하는 유전자의 transcript isoform들 중에서 일부에만 타겟팅이 되었을 수도 있습니다.

shRNA를 디자인할 때, 특정한 isoform만을 대상으로 할 목적이 아니면 가능한 한 많은 transcript isoform이 타겟이 될 수 있도록 디자인하는 것이 좋습니다. VectorBuilder에서는 일반적으로 많이 이용되는 생물종에 대한 최적화된 shRNA들을 포함하는 데이터베이스를 만들었습니다. VectorBuilder 온라인 플랫폼에서 shRNA 벡터를 디자인하면서 shRNA 구성 요소를 지정할 때 데이터베이스 내에서 원하는 유전자로 검색을 할 수 있습니다. 그 다음에 shRNA 들에 대한 상세한 정보를 볼 수 있으며, 이 때 UCSC Genome Browser link를 통하여 유전체 서열과 transcript isoform 상에서 shRNA를 볼 수 있습니다.

shRNA knockdown score는 어떻게 계산됩니까?

VectorBuilder에서는 RNAi consortium (TRC)에서 이용하는 것과 유사한 규칙에 따라서 shRNA의 디자인과 score 계산을 합니다. 하나의 RefSeq transcript에 대하여 candidate target site로 이용될 수 있는 모든 가능한 21mer들을 검색합니다. Candidate들 중에서 knockdown 효율과 특이성 (specificity)을 감소시킬 것으로 생각되거나, 4개 이상의 같은 염기가 반복되거나, 7개 이상의 G 또는 C가 반복되거나, GC 함량이 25% 미만 또는 60%를 초과하거나, 5' end에 AA 서열이 있는 등 클로닝에 문제가 될 수 있는 서열들은 제외됩니다. Candidate가 서열 내부의 stem-loop 구조, 3' end 쪽의 높은 GC 함량, 알려진 miRNA seed 서열을 포함하거나, 다른 유전자에 off-target으로 match되는 경우에는 knockdown score에 불이익을 받게 되어 선택될 가능성이 낮아지게 됩니다. 여러 개의 transcript가 존재하는 유전자의 경우, 모든 transcript에 존재하는 서열이 더 높은 score를 받게 됩니다.

모든 score는 0 이상으로, 평균 5, 표준편차 5 정도의 분포를 나타내며, 95%의 score가 15 이하입니다. Knockdown score가 15 정도인 shRNA들은 최상의 knockdown performance와 클로닝 가능성을 가진 것으로 간주되며, knockdown score가 0 인 경우 최악의 knockdown performance를 가지거나 클로닝이 어려운 shRNA로 간주됩니다.

이러한 knockdown score는 대략적인 가이드에 불과하다는 점에 유의해주시기 바랍니다. 실제 knockdown 효율은 score로 예상되는 것과 큰 차이가 있을 수 있습니다. Score가 낮은 타겟 부위도 실제로는 knockdown을 잘 할 가능성이 있습니다. 타겟 유전자의 3’ UTR도 코딩 부위와 마찬가지로 효과가 있을 수 있습니다.