shRNA Gene Knockdown 솔루션

RNA 간섭 (RNAi)은 관심 유전자의 RNA에 상보적인 짧은 RNA 서열 (~21-23 뉴클레오타이드)을 표적 세포에 도입하여 유전자 조절 방법입니다. 도입된 RNA가 상보적인 내인성 mRNA와 결합하여 생성된 이중 가닥 RNA가 세포에 의해 분해되므로, 번역이 차단되고 유전자 발현이 감소합니다. 이 접근법은 결합되지 않은 일부 mRNA가 기능성 단백질을 계속 생성하기 때문에 유전자를 완전히 knockout 하지는 못합니다.

Short hairpin RNA (shRNA)와 short interfering RNA (siRNA)은 RNAi에 흔히 사용되는 두 가지 방식입니다. shRNA는 안정성이 더 높은 DNA에 암호화된 hairpin 구조로, 장기적인 유전자 knockdown을 제공합니다. 반면 siRNA는 짧고 합성된 RNA로 직접 세포에 전달되어 일시적 knockdown을 유도합니다. 일반적인 siRNA 접근법에 비해 여러 이점을 제공하는 shRNA 매개 유전자 침묵은 대부분의 RNAi 응용에서 선호되는 방법입니다.

shRNA는 바이러스성 또는 비바이러스성 DNA 벡터를 이용해 표적 세포에 도입할 수 있습니다. 세포가 shRNA 벡터로 transfection되거나 transduction되면, shRNA는 핵 내에서 전사되어 hairpin 구조를 형성합니다. 이 구조는 침묵시키려는 표적 mRNA와 동일한 염기서열을 가진 sense strand (Fig. 1의 분홍색 가닥)와, 단일가닥 루프, 그리고 그 sense strand에 상보적인 antisense strand (Fig. 1의 청록색 가닥)으로 구성됩니다. 전사된 shRNA는 핵을 빠져나와 세포질에서 Dicer 효소에 의해 절단·처리되고, 이후 RNA-induced silencing complex (RISC)에 탑재되어 표적 mRNA를 인식하고 분해하는 과정을 수행합니다 (Figure 1).

Figure 1. RNAi 유형의 생성과 기능.

shRNA 발현을 제어하는 ​​데 널리 사용되는 두 가지 접근 방식은 U6 기반 shRNA 발현과 miR 기반 shRNA 발현입니다. U6 기반 shRNA 벡터는 U6와 같은 RNA Polymerase III promoter에 의해 전사되는 단순한 stem-loop shRNA의 발현을 유도하는 반면, miR 기반 shRNA 벡터는 RNA Polymerase II promoter 하에서 microRNA scaffold가 포함된 shRNA를 발현하는 데 사용됩니다. U6 기반 및 miR 기반 벡터 시스템에 의해 발현된 shRNA는 세포질 내에서 유사한 기전을 통해 처리되어 궁극적으로 표적 유전자 침묵을 유도합니다. 그러나 핵 내에서 전사된 후, miR 기반 shRNA는 U6 기반 shRNA와 달리 구조 내에 내인성 miR 기반 서열이 존재하기 때문에 primary miRNA와 유사한 메커니즘을 통해 처리됩니다 (Figure 2).

Figure 2. U6 기반 및 miR 기반 shRNA를 이용한 유전자 발현 억제 메커니즘.

miR 기반 shRNA 벡터에서는 RNA polymerase II promoter를 사용하여 tissue-specific, inducible 또는 다양한 강도의 promoter를 활용할 수 있어, 상시 발현되는 U6 promoter로는 불가능한 다양한 실험 응용이 가능합니다. 또한, miRNA 기반 shRNA 시스템에서 Pol II promoter가 긴 전사체를 효율적으로 생성할 수 있다는 점은 다른 knockdown 벡터 시스템에 비해 여러 이점을 제공합니다. 여러 shRNA miR을 단일 폴리시스트론 (polycistron)으로 전사할 수 있어 세포 내에서 다수의 mature shRNA로 처리되며, 이를 통해 단일 벡터로 여러 유전자를 동시에 knockdown하거나 동일 유전자의 서로 다른 영역을 표적화할 수 있습니다. 이 벡터 시스템에서는 사용자가 선택한 단백질 코딩 유전자를 shRNA miR과 동일한 폴리시스트론 내에 배치할 수 있습니다. Figure 4에서와 같이 마커 ORF를 사용할 경우, 이 ORF를 이용하여 shRNA 전사를 직접 모니터링하거나, ORF와 shRNA의 동시 발현이 필요한 다른 목적으로 활용할 수 있습니다. Figure 3은 U6 기반과 miR30 기반 shRNA 시스템의 실험 비교를 보여줍니다. 약물 선별 전후 knockdown 효율은 일반적으로 U6 기반 시스템이 miR30 시스템의 하나 이상 shRNA 사용에 비해 더 높습니다.

아래 표는 U6 기반 및 miR 기반 shRNA 벡터 시스템을 요약한 것입니다.

VectorBuilder의 design studio는 온라인 shRNA design tool에 포함된 알고리즘을 활용해 효율적인 shRNA를 코딩하는 벡터를 생성할 수 있게 해줍니다. 이 도구는 주요 종에 최적화된 shRNA 데이터베이스를 제공하여 표적 유전자에 대한 높은 knockdown 효율의 shRNA를 설계할 수 있습니다. shRNA 디자인 시 RNAi consortium에서 사용하는 규칙과 유사한 기준을 적용합니다. 각 RefSeq 전사체에 대해 가능한 모든 21mer 후보 표적 사이트로 검색하며, knockdown 효율/특이성 또는 클로닝 가능성을 저하시키는 특징(동일 염기 ≥4 연속, G 또는 C ≥7 이상 연속, GC 함량 <25% 또는 >60%, 5' 말단 AA 등)을 가진 후보는 제외합니다. 모든 스코어는 ≥0이며 평균 ~5, 표준편차 ~5, 95%가 ≤15입니다. knockdown 스코어가 약 15인 shRNA는 최상의 knockdown 성능과 클로닝 가능성을 보이며, 스코어가 0인 shRNA는 가장 저조한 성능 또는 클로닝이 어려운 것으로 예측됩니다.

VectorBuilder의 shRNA 디자인 도구는 데이터베이스에서 표적 유전자를 검색할 수 있는 옵션을 제공합니다. 유전자 이름을 입력하면 해당 유전자에 대한 모든 사용 가능한 shRNA의 상세 정보가 표시되며, UCSC Genome Browser 링크를 통해 shRNA 서열과 모든 전사체 isoform을 확인할 수 있습니다. 데이터베이스는 knockdown 점수를 기준으로 내림차순으로 모든 shRNA를 순위 매기고, 최고 스코어의 상위 3개 shRNA를 추천합니다. knockdown 스코어는 이론적 지침일 뿐이며, 실제 knockdown 효율은 점수 예측과 크게 다를 수 있으므로 낮은 스코어의 표적 사이트도 잘 작동할 수 있음을 유의하십시오.