Library Construction

VectorBuilder는 custom pooled CRISPR 또는 shRNA library를 제작하여 대규모 기능적 스크리닝을 수행할 수 있도록 도와준다. 당사는 최적화된 벡터를 활용하여 고품질의 pooled library를 제작하는데 풍부한 경험을 보유하고 있다. 고객의 요구에 따라 library는 E. coli stock, DNA 또는 packaged virus로 배송될 수 있다. 당사의 custom library는 next generation sequencing으로 완벽하게 검증된다.

How do I obtain pooled CRISPR/shRNA library construction service?

홈페이지에서 디자인 의뢰하기 버튼을 클릭하여 고객님의 요구 사항을 제출하십시오. 당사 과학자들이 가격, 소요시간 및 기타 관련 정보를 포함한 서비스 제안의 링크를 보낼 것이다. 제안서가 만족스러우면 shopping cart에 추가하여, 안내에 따라 주문하면 된다.

Pooled CRISPR/shRNA libraries and their use in genetic screen
Pooled CRISPR libraries

Pooled CRISPR library는 특정 pathways, 질병, 약물 치료에 대한 세포 반응, 발생 과정, 유전자 조절 등과 관련된 coding 또는 noncoding regions의 대규모 또는 게놈 범위의 기능적 스크리닝을 수행하는 강력한 도구이다. 아래 표는 일반적으로 사용되는 CRISPR 기반 스크리닝의 리스트와 그 비교이다.

Screen Type Mechanism Target Location Application
Knockout Wildtype Cas9 or Cas9 nickase is used to cut DNA. When cells attempt to repair DNA breakage, random mutations can be introduced at target sites. Primarily coding regions Mainly for functional screens of coding genes
CRISPRa (activation) Catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a transcriptional activator (e.g. VP64) is used to activate genes regulated by target sites. Typically promoter regions and other noncoding regulatory regions Gain-of-function screen of coding genes, or screens for regulatory functions of noncoding regions
CRISPRi (inhibition) Catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a transcriptional repressor (e.g. KRAB) is used to inhibit genes regulated by target sites. Typically promoter regions and other noncoding regulatory regions Loss-of-function screen of coding genes, or screens for regulatory function of noncoding regions

일반적인 knockout 스크리닝의 경우 pooled CRISPR library는 1-벡터 또는 2-벡터 시스템 방식으로 제조될 수 있다. 1-벡터 시스템에서 Cas9 또는 Cas9 변이체는 동일 벡터로부터 gRNA와 함께 발현되는 반면, 2-벡터 시스템에서는 Cas9 또는 Cas9 변이체는 하나의 벡터로부터 발현되고 gRNA는 별도의 벡터에서 발현된다. 또는 2-벡터 시스템에서 Cas9을 안정적으로 발현하는 cell line에 gRNA-발현 벡터를 도입할 수 있다. 1-벡터 시스템을 사용할 때의 장점은 2개의 다른 벡터를 세포로 co-transfection/transduction 하지 않는다는 것과, Cas9-발현 stable cell line의 가용성에 제한이 없다는 것이다. 그러나 2-벡터 시스템보다 다용성이 낮고 클로닝과 바이러스 패키징의 효율성이 떨어질 수 있다.

Pooled shRNA libraries

Pooled shRNA library는 포유류 세포에서 대규모 또는 게놈 전체 loss-of-function 스크리닝을 수행하는 강력하고 비용 효율적인 도구로 사용될 수 있다. CRISPR 기반 knockout 스크리닝의 주요 단점은 CRISPR-introduced 변이의 확률적 본성으로 인해 특정 타겟 사이트에 대한 knockout 효과에서 세포간의 높은 가변성이다. 대조적으로, pooled shRNA 기반 스크리닝은 일반적으로 특정 타겟 유전자에 대해 세포 전체에 걸쳐 균일한 knockdown 효과를 낸다.
VectorBuilder는 custom pooled shRNA library 제작 외에도 인간과 쥐 유전자를 대상으로 한 고품질의 premade pooled shRNA library를 제공한다. 각 종에 대해 두가지 스케일로 바로 사용 가능한 lentivirus library를 제공한다. Whole Genome (~19,000 RefSeq genes) 및 Elite Gene (~2,000 most frequently cited genes on PubMed Central)이 있다. 가능한 경우 각 유전자는 5~6개의 서로 다른 shRNA의 타겟이 된다. 이러한 library는 next-generation sequencing 및 기능 분석에 의해 완전히 검증되었다.

View more information of premade pooled shRNA libraries

Overview of services
Available Services Brief Description Price Turnaround
Design custom library construction strategy Free 1-4 days*
Custom pooled CRISPR or shRNA library construction Includes array-based oligo synthesis of gRNA/shRNA, cloning of gRNA/shRNA into desired vector backbone, and preliminary validation of the plasmid pool by Sanger sequencing. ** From $2,000 3-5 weeks
Amplification of premade plasmid library pool*** If you have a premade library in the form of a plasmid pool (e.g. CRISPR plasmid pool obtained from Addgene), we can package it into virus for you. An amplification step is often needed to obtain enough DNA for virus packaging. For this, the plasmid pool is transformed into E. coli cells with an average of >100x representation, and E. coli glycerol stocks are prepared for long-term storage. ** From $300 3-5 days
Library DNA preparation >1 ug/ul, 150 ul, 1x TE buffer, endotoxin-free, sterile $139 4-6 days
Virus packaging of pooled library Please click here to view detailed scales of virus packaging services. ****
NGS validation of premade plasmid library pool We can validate the quality of your premade plasmid library pool by NGS before and/or after amplification. This includes NGS library preparation from plasmid pool, Illumina sequencing (>500x coverage), and data analysis. From $300 3-4 weeks
NGS deconvolution of post-screening sample Includes NGS library preparation from genomic DNA of screened cells, Illumina sequencing (> 500x coverage), and data analysis. From $200 per sample 5-7 weeks
Other custom library construction Please inquire

* gRNA 또는 shRNA의 디자인이 필요한 경우 특정 프로젝트의 소요시간이 더 길어질 수 있다.
** 기본 제공 제품은 E. coli glycerol stock이다.
*** Premade plasmid pool을 고객이 제공하는 경우,  시료 제출 양식의 가이드라인에 따라 벡터를 보내 주세요. 당사로 시료를 발송할 때 어떠한 지연 또는 시료의 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주십시오. 고객이 제공한 모든 시료는 VectorBuilder에 의해 필수 QC를 수행하며 각 품목에 대해 $100의 추가 요금이 부과될 수 있다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지 생산이 시작되지 않는다는 점에 유의하십시오. 고객이 제공한 premade plasmid library pool의 경우 library의 복잡성이나 균일성에 관하여는 어떠한 보증도 제공할 수 없다.
**** Library plasmid 패키징 비용은 단일 클론에서 발생하는 plasmid 패키징 비용의 1.5배이다.

Detailed description of services
Design custom library construction strategy

타겟 유전자 또는 유전체 영역에 대한 gRNA 또는 shRNA 서열을 디자인하는 데 도움이 필요하다면, 당사는 최적화된 파이프라인과 강력한 computational resources를 사용하여 이를 디자인하는데 도와드릴 수 있다. 연구 니즈에 따라, lentivirus, adeno-associated virus (AAV), piggyBac 및 regular plasmids와 같은 library 제작을 위한 다양한 검증된 벡터 backbone 중에서 선택할 수 있다. 2-벡터 CRISPR library의 경우, 스크리닝 전략에 적합한 Cas9 또는 Cas9 변이체 발현 벡터를 디자인하고 제작할 수 있다.

Custom pooled CRISPR/shRNA library construction

당사는 chip 기반의 방식을 사용하여 오류율의 낮은 고품질 gRNA 또는 shRNA oligo pool을 합성한다. 그러면 oligo는 최소 사이클 수로 PCR 증폭되어 평균 100배 이상의 representation로 원하는 벡터 backbone에 효율적으로 클로닝된다. CRISPR/shRNA library plasmids를 갖는 E. coli 세포를 증식시켜 exponential growth phase에서 채취하여 glycerol stocks을 만든다. Library의 품질을 평가하기 위해 gRNA/shRNA plasmid pool에 대한 NGS를 수행한다 (sequencing depth at >500x coverage). NGS 데이터를 분석하여 pool에서 normalized abundance를 갖는 모든 디자인된 gRNA/shRNA를 리포트한다.

Amplification of premade plasmid pool

다른 소스(예: Addgene)에서 제공하는 premade plasmid library pool을 증폭해 줄 수 있다. 먼저 pooled plasmid를 평균 100배 이상의 representation을 가진 super-competent cells에 transformation 시킨다. 그리고 E.coli 세포는 exponential growth phase에서 채취하여 glycerol stock을 만든다. Downstream 바이러스 패키징을 요청하면 plasmid DNA를 maxi prep에 의해 분리한다. 실제 평균 gRNA/shRNA fold representation을 평가하기 위해 transformation 후 콜로니 수를 계산한다.
또는 transformation 전후에 plasmid pool의 NGS 검증을 수행할 수 있다. VectorBuilder에 의해 제작되지 않은 plasmid pool의 경우, 콜로니 계수로 추산한 평균 100x average representation을 보장하지만, 당사는 고객의 premade plasmid pool의 구성요소들을 통제할 수 없기 때문에 library의 복잡성이나 균질성 (the complexity or uniformity of the library)을 보장할 수는 없다는 점에 유의하십시오.

Virus packaging of pooled library

CRISPR/shRNA 스크리닝의 경우 lentivirus나 adeno-associated virus에 의한 감염 등 바이러스 transduction을 통해 pooled library를 세포로 전달할 필요가 있다. VectorBuilder는 titer, 순도, 생존성, 일관성 측면에서 바이러스 패키징 프로토콜을 크게 개선시킨 다양한 독점 기술과 시약을 개발하였다. 당사의 패키징 프로토콜은 또한 클로닝 서비스에 사용되는 바이러스 벡터 시스템에 최적화되어 있다. 그 결과 클로닝과 바이러스 패키징에 대한 니즈에 만족하여 당사에 반복적으로 의뢰하는 고객들이 많아지고 있다.
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NGS deconvolution of post-screening sample

스크리닝을 수행한 후 NGS의 hit를 확인하는 방법을 모르세요? 샘플의 게놈 DNA를 VectorBuilder로 보내면, 당사에서 NGS library를 제조하고, high-throughput sequencing을 수행하고, 데이터를 분석하여, 각 샘플의 gRNA/shRNA의 정확한 카운트를 몇 주 안에 고객에게 전달할 것이다.
시퀀싱이 완료되면 이메일로 고객에게 통지하고 고객에게 raw sequencing 및 analyzed data를 다운로드할 수 있는 FTP 링크를 제공할 것이다. 당사는 고객의 데이터를 당사 FTP 사이트에 3개월 동안 무료로 보관할 것이지만, 데이터를 더 오래 보관하도록 요청할 수 있다.

Other custom library construction

Phage display, two-hybrid 또는 gene expression library 등 CRISPR/shRNA 이외의 대규모 스크리닝을 수행하기 위해 custom-built vector library가 필요한 경우, VectorBuilder가 도움이 될 수 있다.  디자인 의뢰하기를 통해 요청사항을 제출하면, 당사의 과학자들이 1~2일 내에 상세한 서비스 제안서로 연락할 것이다.