Library 제작 (Library Construction)

VectorBuilder는 대규모의 functional screening을 위한 맞춤형 pooled library를 제작해드릴 수 있습니다. 당사는 최적화된 벡터와 자체의 기술을 이용하여 고품질의 pooled library를 제작하는 춤부한 경험을 보유하고 있습니다. 고객의 요구에 따라 library는 E. coli stock, DNA 또는 재조합 virus로 배송될 수 있습니다. 당사의 custom library는 next generation sequencing (NGS)으로 완벽하게 검증되기 때문에, 받으시는 그대로 믿고 사용하실 수 있습니다.

제작 가능한 맞춤형 library:
  • CRISPR libraries (CRISPR KO, CRISPRa/i,             CROP-seq, Perturb-seq 등)
  • shRNA libraries
  • Barcode libraries
  • Enhancer/promoter screening libraries
  • Peptide expression libraries
  • DNA shuffling libraries
  • Two-hybrid libraries
  • Capsid screening libraries
  • 기타 library

서비스 세부 사항

가격 및 소요 시간
Service Brief Description Price (USD) Turnaround
Design library construction strategy* 무료 1-4 일
Pooled library construction 올리고 및 유전자 합성, 대량의 parallel 클로닝에 의한 적절한 벡터 backbone으로의 클로닝, Sanger sequencing에 의한 plasmid pool의 예비적인 확인 등이 포함됩니다. ** > $2,000 3-5 주
Amplification of premade plasmid pool**** Addgene에서 얻어진 CRISPR plasmid pool과 같이 고객이 제공하는 plasmid pool 형식의 premade library를 바이러스로 패키징 해드릴 수 있습니다. 이 때 바이러스 패키징을 위한 충분한 DNA를 얻기 위하여 증폭이 필요할 수 있습니다. 이를 위하여 100배 이상 representation을 하도록 plasmid pool을 E. coli로 형질전환하고, 장기간 보존을 위하여 E. coli glycerol stock을 만듭니다. ** > $300 3-5 일
Library DNA preparation >1 ug/ul, 150 ul, 1x TE buffer, endotoxin-free, sterile $139 4-6 일
Virus packaging of pooled library 바이러스 패키징 서비스의 구체적인 규모를 보시려면 여기를 눌러주시기 바랍니다. ***
NGS validation of premade pooled library**** 고객의 premade pooled library의 품질을 증폭 전후로 NGS에 의하여 확인해드릴 수 있습니다. 여기에는 plasmid pool에서 NGS library 만들기, Illumina sequencing (>500x coverage), 그리고 데이터 분석이 포함됩니다. > $300 3-4 주
NGS deconvolution of post-screening sample Screening한 세포에서 얻어진 유전체 DNA에서 NGS library 만들기, Illumina sequencing (>500x coverage), 그리고 데이터 분석이 포함됩니다. 샘플당 > $200 5-7 주

* 이 무료 서비스는 클로닝 전략 디자인에 제한됩니다. gRNA와 shRNA의 variable region을 위한 서열 디자인에는 추가 비용 및 소요 시간이 발생할 수 있습니다.

** 기본적인 결과물은 E. coli glycerol stock입니다.

*** Library plasmid를 위한 패키징 서비스 가격은 단일 벡터 plasmid 패키징 가격의 1.5배입니다.

**** VectorBuilder에 의하여 제작되지 않은 premade pooled library에 대해서는 당사에서 premade library의 조성에 대한 제어가 불가능하기 때문에, library의 복합도와 균일성에 대하여 보장해드릴 수 없습니다.

기술적인 정보

Pooled CRISPR library와 shRNA library에 의한 genetic screeningView more

Pooled CRISPR library

Pooled CRISPR library는 특정한 경로, 질병, 약물 처리에 대한 세포의 반응, 발생 과정, 유전자 발현 조절 등에 관련된 coding 또는 noncoding 영역의 대규모 또는 유전체 규모의 functional screening을 위한 강력한 툴입니다. 아래의 표는 일반적으로 많이 사용되는 CRISPR 기반의 screening 방법들을 비교하여 기술한 것입니다.

Screening 전략 방법 Target의 위치 적용 분야
CRISPR KO Wildtype Cas9 또는 Cas9 nickase로 DNA를 절단합니다. 세포가 DNA 절단 부위를 복구하는 과정에서 절단 부위에 임의로 변이가 도입됩니다. 주로 coding 하는 서열 주로 단백질을 coding하는 유전자의 functional screening
CRISPRa 촉매 활성 부위가 비활성화된 Cas9 (dCas9)을 VP64와 같은 transcription activator와 융합하여 target 서열에 의하여 조절되는 유전자의 발현을 활성화합니다. 주로 promoter나 다른 noncoding 발현 조절 서열 Coding하는 유전자의 gain-of-function screening 또는 noncoding 영역의 발현 조절 기능 screening
CRISPRi 촉매 활성 부위가 비활성화된 Cas9 (dCas9)을 KRAB과 같은 transcription repressor와 융합하여 target 서열에 의하여 조절되는 유전자의 발현을 억제합니다. 주로 promoter나 다른 noncoding 발현 조절 서열 Coding하는 유전자의 loss-of-function screening 또는 noncoding 영역의 발현 조절 기능 screening

맞춤형 pooled CRISPR library 제작 외에도, VectorBuilder에서는 사람과 생쥐 유전자들에 대한 고품질의 premade 이중 gRNA library를 제공합니다. 사람과 생쥐의 이중 gRNA library는 각각 20,048개의 사람 유전자와 20,493개의 생쥐 유전자를 타겟으로 하는 즉시 사용할 수 있는 높은 titer의 pooled 렌티바이러스로 제공됩니다. 각각의 유전자는 4-6 쌍의 gRNA에 의하여 중복적으로 타겟팅 될 수 있도록 제작되었습니다. 이들 library는 NGS와 functional assay를 통하여 완전히 확인되었습니다.

VectorBuilder의 premade 이중 gRNA library에 대한 더 많은 정보를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

Pooled shRNA library

Pooled shRNA library는 포유류 세포 내에서 대규모 또는 유전체 규모의 loss-of-function screening을 하기 위한 강력하면서 비용 효율적인 툴입니다. CRISPR 기반의 knockout screening의 큰 단점이 주어진 타겟에 CRISPR에 의해 도입되는 변이가 확률적으로 일어나기 때문에 세포에 따라 knockout 효과의 차이가 크다는 점입니다. 반면에 pooled shRNA에 기반한 screening은 일반적으로 주어진 타겟에 대하여 세포들간의 knockdown 효과가 균일하게 얻어집니다.

맞춤형 pooled shRNA library 제작 외에도, VectorBuilder에서는 사람과 생쥐 유전자들에 대한 고품질의 premade pooled shRNA library를 제공합니다. 각각에 대하여 다음과 같은 두가지 규모의 즉시 사용할 수 있는 렌티바이러스 library가 제공됩니다. Whole Genome library는 19,000여개의 RefSeq 유전자들을 대상으로 하며, Elite Gene library는 2,000여개의 PubMed Central에서 가장 빈번히 인용되는 유전자들을 대상으로 하여 제작되었습니다. 각각의 유전자는 5-6 개의 다른 shRNA에 의하여 타겟팅 될 수 있도록 제작되었습니다. 이들 library는 NGS와 functional assay를 통하여 완전히 확인되었습니다.

VectorBuilder의 premade 이중 gRNA library에 대한 더 많은 정보를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.
Pooled library 제작 워크플로우View more

Library 제작을 위한 전략 디자인

고객의 타겟 유전자나 유전체 내 영역들의 목록에 대한 gRNA 또는 shRNA 서열을 디자인하는데 도움이 필요하시면, VectorBuilder가 자체의 최적화된 pipeline과 강력한 컴퓨팅 자원으로 도와드릴 수 있습니다. 연구에서 요구되는 바에 따라서 렌티바이러스, 아데노부속바이러스 (AAV), piggyBac 또는 일반 plasmid를 벡터 backbone으로 하여 library를 제작할 수 있습니다. 2-벡터 CRISPR library를 제작하는 경우, screening 전략에 적합한 Cas9 또는 변이된 Cas9 발현 벡터를 디자인하고 제작할 수 있습니다.

Pooled library 제작

VectorBuilder는 chip에 기반한 방법으로 낮은 오류율을 가진 고품질의 gRNA 또는 shRNA 올리고 pool을 합성합니다. 올리고들은 최소한의 cycle로 PCR에 의하여 증폭되어 평균 100배 이상의 representation을 얻을 수 있도록 적절한 벡터 backbone에 클로닝됩니다. Library plasmid들을 가진 E. coli 세포들을 증식하고 지수성장기 (exponential phase) 에서 회수하여 glycerol stock을 만듭니다. Library의 품질을 평가하기 위하여 plasmid pool을 500배 이상의 coverage를 가질 수 있는 sequencing depth에서 NGS를 하고, NGS 데이터를 분석하여 pool 내에 모든 디자인된 variable region의 서열들이 표준화된 양 (normalized abundance) 으로 존재하는지를 확인합니다.

Premade plasmid pool 증폭

VectorBuilder는 Addgene과 같은 다른 출처에서 얻어진 premade plasmid library pool을 증폭해드릴 수 있습니다. 먼저 100배 이상의 representation을 얻을 수 있도록 pooled plasmid들을 super-competent E. coli에 형질전환합니다. E. coli 세포들을 지수성장기 (exponential phase) 에서 회수하여 glycerol stock을 만듭니다. 바이러스 패키징을 요청하시면,  plasmid DNA를 maxi prep으로 정제합니다. 실제 평균적인 library coverage를 추정하기 위하여 형질전환 후에 콜로니의 숫자를 측정합니다.

Pooled library의 바이러스 패키징

CRISPR/shRNA screening을 위하여 pooled library를 렌티바이러스나 AAV를 이용한 바이러스 transduction에 의하여 세포 내로 전달할 필요가 있을 수 있습니다. VectorBuilder는 바이러스 패키징의 titer, 순도, 활성, 일관성 등을 크게 향상시킬 수 있는 자체의 기술과 시약들을 지속적으로 개발해왔습니다. 당사의 패키징 protocol은 당사의 클로닝 서비스를 위해 사용되는 바이러스 벡터 시스템을 위하여 최적화되어 왔습니다. 그 결과로 기존의 고객이 다시 클로닝과 바이러스 패키징을 위하여 당사의 서비스를 이용하고 만족스러운 결과를 얻게 되는 경우가 점차로 늘고 있습니다.

바이러스 패키징 서비스에 대한 더 많은 정보를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

Screening에서 얻어진 샘플의 NGS deconvolution

VectorBuilder는 고객의 CRISPR 또는 shRNA screening에 의하여 얻어진 샘플로부터 NGS에 의하여 유효한 gRNA 또는 shRNA들을 찾아드릴 수 있습니다. 샘풀의 유전체 DNA를 VectorBuilder에 보내주시면 당사에서 NGS library를 만들고, NGS를 한 후에 결과를 분석하여 수 주 이내에 각각의 샘플 내에 있는 gRNA 또는 shRNA의 정확한 수를 보내드릴 수 있습니다. Sequencing이 완료되면 sequencing 데이터 및 분석 결과를 다운로드하실 수 있는 FTP link를 이메일로 보내드립니다. 데이터는 FTP site에 3개월간 무료로 보관해드리며, 요청시에 보관 기간 연장이 가능합니다.

주문 방법

고객이 제공하는 library plasmid pool

고객이 제공하는 premade plasmid pool이 사용되는 경우, 시료 제출 가이드라인 에 따라서 시료를 보내주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며, 시료의 타입이나 용도에 따라 시료당 $100이상의 추가 QC 요금이 부과될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다. 고객이 제공하는 premade plasmid pool에 대해서는 당사에서 library의 복합도와 균일성에 대하여 보장해드릴 수 없습니다.

자주 묻는 질문

CRISPR에 의한 knockout을 하기 위하여 단일 gRNA 또는 이중 gRNA 중에서 어느 쪽을 선택하는 것이 좋습니까?

CRISPR의 의한 유전체 편집에 있어서 Cas9 nuclease는 특정한 부위에 결합한 guide RNA (gRNA)에 의하여 유도 됨으로써 DNA를 절단하게 됩니다. 대부분의 경우에 유전자 knockout을 위해서는 단일 gRNA가 Cas9과 함께 사용됨으로써 double-strand break (DSB)를 만들게 되고, 이는 non-homologous end joining (NHEJ) 에 의하여 비효율적으로 복구가 일어나게 됩니다. 그 결과로 복구 부위에 작은 DNA 서열의 삽입 및 삭제가 일어나서 영구적인 변이가 도입됩니다. 이들 변이 중 일부에서 frame-shift가 일어나거나 stop 코돈이 생겨서 translation이 조기에 끝나게 함으로써 유전자의 기능이 상실되게 합니다.

이중 gRNAs는 하나의 타겟 부위에 두 strand를 각각 Cas9_D10A nickase를 사용하여 절단하는 경우에 사용됩니다. 이 방법에 의하면, 양쪽 strand에 각각 gRNA가 결합하여 Cas9_D10A를 가이드하고 nickase 활성으로 각각의 strand만을 절단함으로써 결과적으로 타겟 부위에 DSB가 생기게 합니다. 일반적으로, 이 방법은 두개의 gRNA가 모두 타겟에 결합하여야만 DSB가 생기기 때문에 CRISPR/Cas9에 의한 off-target 효과를 감소시킬 수 있습니다.

또한 이중 gRNA는 Cas9_D10A nickase와 외부에서 제공되는 donor DNA template을 사용하여 원하는 유전자에 knockin과 같은 특정한 서열 변화를 도입하고자 할 때 사용될 수 있습니다. 이 경우에 두개의 gRNA에 의한 타겟팅으로 양쪽 strand가 잘라진 후에 복구를 위하여 donor DNA template를 이용하는 homology-directed repair (HDR) pathway에 의하여 도입이 됩니다.

VectorBuilder의 이중 gRNA vectors에 대한 선택사항들을 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.
CRISPR knockout screening을 위하여 1-벡터 시스템과 2-벡터 시스템 중에서 어느 쪽을 선택하는 것이 좋습니까?

일반적인 knockout screening을 위하여 pooled CRISPR library를 1-벡터 또는 2-벡터 시스템을 사용하여 제작할 수 있습니다. 1-벡터 시스템에서는 Cas9 또는 변이 Cas9 이 gRNA와 같은 벡터에서 발현이 되며, 2-벡터 시스템에서는 Cas9 또는 변이 Cas9 이 gRNA와 별개의 벡터에서 발현이 됩니다. 2-벡터 시스템을 시용하는 경우, gRNA를 발현하는 벡터를 Cas9을 안정적으로 발현하는 세포주에 도입하여 사용할 수도 있습니다. 1-벡터 시스템의 경우, 두 가지 벡터를 동시에 transfection/transduction 해야 할 필요가 없으며, Cas9을 안정적으로 발현하는 세포주가 따로 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 하지만, 다양성이 좀 제한되고 클로닝 및 바이러스 페키징의 효율이 2-벡터 시스템에 비하여 덜 효율적인 단점도 있습니다.