mRNA 유전자 전달 솔루션 (mRNA Gene Delivery Solutions)
VectorBuilder는 백신, 유전자 편집, chimeric antigen receptor (CAR), 세포 또는 배아에서의 단백질 발현과 같은 mRNA 기반 치료제 개발을 위한 원스톱 솔루션을 제공합니다. 광범위한 디자인 및 생산 경험을 바탕으로 mRNA 기반 백신 및 유전자 치료 개발을 가속화 할 수 있도록, in vitro transcription (IVT) 벡터 디자인, 벡터 클로닝, in vitro mRNA 합성, mRNA-LNP 생산 및 in vitro/in vivo 기능 테스트를 지원하고 있습니다.
서비스 세부 사항
IVT 벡터 디자인 및 클로닝
- 고효율 in vitro transcription에 최적화된 VectorBuilder의 백본을 기반으로 하는 IVT 벡터 디자인 (Figure 1).
- 내부적으로 검증된 다양한 5' 및 3' UTR 및 polyA tails (110bp polyA tail 포함) 제공.
- 다운스트림 linearization, capping 및 polyadenylation과 호환되는 고객 맞춤형 IVT 벡터 클로닝.
- 문헌 기반, 컴퓨터 계산 및 실험적 접근을 통한 코돈 최적화 지원.
Figure 1. IVT 벡터의 일반 맵
In vitro mRNA 합성 및 lipid nanoparticle (LNP) encapsulation
- ug에서 수백 mg 스케일까지 최대 10,000 nt의 conventional 및 self-amplifying mRNA를 위한 T7 RNA polymerase 기반 합성.
- Cap 1으로 5’ capping 및 3' 템플릿 기반 110 nt polyA tail로 mRNA 안정성 및 translation 향상.
- N1-Methylpseudouridine(m1Ψ) 및 5-Methylcytosine(m5C)과 같은 변형된 nucleotide는 mRNA translation 및 immune evasion을 향상시키기 위해 합성 중에 포함될 수 있습니다.
- 마그네틱 비드 및 크로마토그래피를 포함한 다양한 RNA 정제 옵션.
- mg 스케일의 고품질 mRNA-LNP 패키징.
- 포괄적인 품질 관리 및 LNP 프로파일링
- 대용량 mRNA 제조를 위한 공정 개발 및 스케일 업.
mRNA 기반 유전자 전달의 in vitro 및 in vivo 테스트
- VectorBuilder의 high-throughput 클로닝, 생산 및 테스트 플랫폼을 기반으로 실험 중심 전략을 활용하여 mRNA UTR, 코딩 서열 및 생산 방법을 최적화합니다.
- Antigen presentation, antibody expression, CAR expression 및 CRISPR 등 다양한 응용분야에 대한 기능 검증 플랫폼을 구축하였습니다.
- 설치류 및 NHP(nonhuman primates)를 포함한 동물 모델을 사용하여 mRNA-LNP 유전자 전달 효능 및 안전성을 평가하기 위해 임상 지향적인 CRO 서비스를 제공합니다.
기술적인 정보
mRNA 기반 치료제의 장점
Messenger RNA (mRNA)를 사용하여 인간에서 치료 단백질을 발현하는 것은 수십년 동안 동물 모델에서 제안되고 테스트되어 왔습니다. mRNA 생물학에 대한 향상된 이해와 mRNA in vitro transcription (IVT) 및 lipid nanoparticle (LNP) 기술의 최근 발전 덕분에 몇가지 기술적 장애물이 해결되어, SARS-CoV-2 mRNA 백신을 발병 이후 전례 없는 속도로 실현할 수 있게 되었습니다. mRNA는 다른 생물학적 제제에 비해 고유한 장점을 가지고 있어 의약품으로의 개발 및 이용에 유망한 후보입니다.
첫째, 재조합 단백질 의약품과 달리 LNP에 운반되는 mRNA는 세포막을 통과해 효율적으로 전달되고, 표적 세포에서 치료 단백질로 빠르게 translation될 수 있습니다. 직접적인 세포막 전위를 통한 세포질로의 치료 단백질의 세포내 전달은 막 불투과성 및 전하나 분자량과 같은 단백질의 특성에 의해 종종 제한적입니다. 대부분의 세포외 단백질은 엔도솜 흡수를 통해 들어가고 일반적으로 엔도솜 구획에 격리되고 protease에 의해 분해됩니다. 세포질로의 성공적인 단백질 전달이 일어나기 위해서는 표적 단백질이 종종 세포막 전위 또는 엔도솜 탈출을 위한 추가적인 변형이 되어야 합니다. mRNA의 경우 LNP는 세포막과 융합하여 encapsulated mRNA를 세포질로 방출할 수 있습니다. 또한, 표적화된 mRNA in vivo 발현은 기능화된 LNP와 최적화된 mRNA UTR을 결합하여 달성할 수 있습니다. 둘째, 핵에 외래 DNA를 영구적으로 남기거나 숙주 세포 게놈에 통합되는 많은 바이러스 벡터와 달리 mRNA는 게놈을 변경하지 않고 수일 내에 숙주 세포에 의해 분해됩니다. 바이러스 벡터 기반 백신은 중요한 조절 또는 코딩 영역에서 통합이 발생하는 경우, 세포에 유해한 영향을 미칠 수 있는 삽입 돌연변이 유발의 위험이 있습니다. 셋째, mRNA의 생산은 바이러스 벡터보다 비용 효율적이고 스케일 업이 더 용이할 수 있습니다. mRNA in vitro transcription은 cell free system에서 일어나기 때문에, cell 유래 불순물과 오염이 더 이상 문제가 되지 않으며, 공정 개발 및 대규모 생산을 위한 표준화가 용이해집니다. 종합적으로 mRNA-LNP는 백신 개발, 단백질 대체, 게놈 편집 등의 유망한 후보로 떠오르고 있으며, VectorBuilder는 디자인, 생산 및 최적화에 필요한 서비스를 제공하고 있습니다.
mRNA 생산 프로세스 및 QC
Figure 2. mRNA 합성 및 LNP 패키징의 일반적인 워크플로우
Figure 2에 표시된 것처럼 일반적인 mRNA 생산 워크플로우는 선호하는 코돈, GC 함량 및 RNA 2차 구조의 열역학적 안정성을 고려하여 템플릿 DNA 서열을 디자인하고 합성하며, in vitro transcription 벡터에 클로닝 합니다. 그런 다음 plasmid DNA를 정제, 검증 및 선형화한 후 in vitro transcription 반응을 거쳐 원하는 전사체를 생성합니다. m1Ψ 및 m5C와 같은 변형된 뉴클레오타이드는 in vitro transcription 반응에 결합되어 in vivo translation을 개선하고 면역원성을 감소시킬 수 있습니다. Co-transcription 또는 enzyme 방식을 사용하여 고효율 capping (>95%)을 달성할 수 있습니다. 그런 다음 mRNA는 기본 정제 프로세스인 mRNA 캡처 비드로 정제하고, 또는 별도 요청시에는 oligo dT 크로마토그래피로 정제합니다. 아래 표의 QC 분석은 mRNA integrity 및 purity 평가를 위해 커스터마이징할 수 있습니다. 다음으로, mRNA는 microfluidic mixer에서 LNP에 추가로 encapsulation될 수 있습니다. Encapsulation 효율 및 나노입자 프로파일링은 아래 표의 방법을 사용하여 분석됩니다.
| QC Items | Methods |
|---|---|
| mRNA identity | Reverse transcription followed by Sanger sequencing |
| mRNA integrity and purity | Denaturing gel electrophoresis, capillary electrophoresis |
| Capping efficiency | LC-MS |
| PolyA tailing efficiency | LC-MS |
| dsRNA residue | ELISA |
| Template DNA residue | PicoGreen staining, qPCR |
| Protein residue | BCA, NanoOrange staining |
| mRNA encapsulation efficiency | RiboGreen staining |
| LNP particle size, PDI, and surface charge | Dynamic light scattering (DLS), TEM |
| Endotoxin level | LAL assay |
| Sterility | Bioburden tests |
실험에 의한 검증
Luciferase 및 EGFP를 코딩하는 IVT mRNA의 발현 및 기능은 in vitro (Figure 3) 및 in vivo (Figure 4) 에서 테스트되었습니다.
Figure 3. 293T 또는 HeLa 세포에서 luciferase 및 EGFP mRNA의 발현. mRNA는 변형된 뉴클레오타이드, N1-Methylpseudouridine (m1Ψ) 및 5-Methylcytosine (m5C)을 포함하거나 포함하지 않고 생성되었습니다. 12-well 플레이트에서 성장한 세포를 well당 1ug의 mRNA로 transfection시켰습니다. (A) Transfection 후 6시간, 24시간 및 48시간에 293T 세포에서 luciferase 활성. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 293T 세포 (B) 및 HeLa 세포 (C)에서 EGFP 발현은 24시간, 48시간 및 72시간 transfection후 flow cytometry로 정량화되었습니다. 평균 형광 강도는 컬러 막대로 표시되었고 EGFP 양성 세포의 백분율은 원, 사각형 및 삼각형으로 표시되었습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (D) 현미경(100X)으로 관찰한 transfection후 72시간에서 293T 세포 및 HeLa 세포에서의 EGFP 발현.
Figure 4. 마우스에서 luciferase(Luc) mRNA 및 mRNA 유도 면역 반응. (A) Injection 후 6시간, 24시간 및 48시간에 라이브 이미징으로 시각화된 luciferase 활성. (B) 두가지 pro-inflammatory cytokines인 IL-6 및 TNF-⍺가 injection 후 48시간에 혈청에서 정량화되었습니다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. Mice strain: C57BL/6J; mice age: 8 weeks; injection method: intramuscular injection. (C) 바이러스 항원 A, 바이러스 항원 B 또는 대조군 PBS를 코딩하는 30ug LNP-encapsulated mRNA의 intramuscular injection 14일 후 Balb/C 마우스에서 유래된 비장세포의 IFN-γ ELISpot 분석.
문서 자료
Material Safety Data Sheet (MSDS) 브로셔주문 방법
FAQ
Cap 0는 5’ to 5’ triphosphate linkage를 통해 진핵생물 mRNA의 5' 말단에 추가되는 N7-methylguanosine (m7G)을 나타냅니다. 이 변형은 co-transcription으로 발생하는 일련의 효소 반응을 통해 추가되고, nuclear export, 전사체 안정성을 조절하는 기능을 하고, eukaryotic translation initiation factor (eIF4E)에 의한 인식을 통해 mRNA의 translation을 촉진하는 기능을 합니다. Cap 1은 m7G cap 외에 전사된 mRNA 서열의 첫번째 뉴클레오타이드 (m7GpppNm)의 2'O에 메틸기가 추가된 것을 의미합니다. 포유류 세포에서 cap 1 구조는 mRNA가 선천성 면역에 의해 표적화되지 않고 자가로 인식되는 중요한 마커이다. 합성된 mRNA에 cap 1 구조를 추가하면 in vivo에서 mRNA 발현이 향상되고 면역원성이 감소하는 것으로 입증되었습니다.
In vitro transcription된 RNA에 대한 capping은 cap analogs와 함께 co-transcription되거나 또는 효소 반응을 통해 transcription 후에 발생할 수 있습니다. VectorBuilder는 두가지 capping 방법을 모두 제공하며 LC-MS를 사용하여 그 효율성을 검증했습니다. 고객이 선호하는 capping 방법에 따라 IVT mRNA 벡터를 클로닝하기 위한 호환 가능한 백본을 선택합니다.
세포는 외부 RNA를 인식하면 면역 반응을 활성화하는 cytosolic 및 endosomal RNA receptors를 갖고 있습니다. 변형된 뉴클레오타이드는 일반적으로 endogenous cellular RNA에서 발견됩니다. IVT mRNA에 특정 변형된 뉴클레오타이드를 결합하면 면역원성이 감소하고, 2차 구조가 변경되며, 서열 의존적 방식으로 translation 효율과 반감기가 증가합니다. VectorBuilder는 일반적으로 사용되는 N1-Methylpseudouridine(m1Ψ) 및 5-Methylcytosine(m5C)을 포함하여 다양한 변형 뉴클레오타이드를 제공합니다. N1-Methylpsuedouridine 및 5-Methylcytosine은 tRNA에서 처음 확인된 자연 발생 뉴클레오타이드이지만, mRNA를 코딩하는데 사용하는 것을 최근에야 알게 되었습니다. Uridine 과 cytosine의 이러한 메틸화된 유도체는 전통적인 Watson-Crick base pairing을 변경하지 않고 mRNA IVT 및 translation에서 표준 뉴클레오타이드를 대체할 수 있습니다. mRNA 치료제에 사용하는 주요 장점은 RNA immune receptors에 의한 인식을 변경하여 원치 않는 면역 효과를 완화하고 전사체 안정성 및 translation을 향상시키는 능력입니다.