벡터에 어떤 마커를 넣어야 하나요?

적절한 selection marker를 선택하는 것은 벡터 디자인에 있어 중요한 단계입니다. Selection marker를 사용하면 실험자는 벡터로 transfection되거나 transduction된 세포를 성공적으로 식별할 수 있습니다.

양성으로 transfection되거나 transduction된 세포를 선택하는데 일반적으로 두 가지 유형의 마커, 즉 drug selection marker와 형광 단백질 마커가 사용됩니다. VectorBuilder는 벡터에 puromycin (Puro), neomycin (Neo), hygromycin B (Hygro) 및 blasticidin (Bsd)과 같은 다양한 drug selection marker를 제공합니다. 이는 벡터를 운반하는 세포에서 해당 항생제에 대한 저항성을 부여하는 기능을 합니다. 반면에 벡터를 보유하지 않는 세포는 항생제에 내성이 없으므로 항생제가 있는 경우 죽습니다. 형광 마커를 사용하면 연구자는 형광 현미경으로 시각화하거나 FACS를 통해 형질도입된 세포를 선택할 수 있습니다.

Drug selection marker에 대한 민감도는 세포 유형마다 크게 다를 수 있습니다. 일부 세포는 저항성 유전자가 없어도 특정 항생제에 대해 자연적으로 일부 저항성을 갖는 경우도 있고, 어떤 세포는 저항성 유전자가 있어도 특정 항생제에 민감합니다. 따라서 다양한 drug selection marker를 테스트하여 세포 유형에 가장 적합한 마커를 찾아야 합니다. 일반적으로 puromycin (Puro)이 다른 항생제보다 더 빠르고 지속적으로 비저항성 세포를 죽인다는 것을 발견했습니다. 이러한 이유로 대부분의 세포에 puromycin (Puro)을 권장합니다.

최적의 항생제가 선택되면 antibiotic kill curve를 수행하여 최적의 항생제 농도와 표적 세포를 죽이는데 필요한 선별 기간을 결정하는 것도 중요합니다. 이것은 실험 세포 집단에서 양성으로 transfection되거나 transduction된 모든 세포의 존재를 보장하여 변동성을 줄이고 장기적인 유전자 발현이 필요한 실험에 필요한 경우 안정적인 세포주를 확립하는 데 도움이 됩니다. 아래 표에는 일반적인 세포주에서 일반적으로 사용되는 약물의 권장 농도와 선택 기간이 표기되어 있습니다.

Drug-selection marker는 시간이 많이 걸릴 수 있는 안정적인 세포 집단을 확립하여 장기적인 유전자 발현이 필요한 실험에 적합하지만, 반면에 형광 마커는 형광 현미경으로 시각화하여 양성 형질감염/전이 세포를 선택하는 비교적 간단하고 빠른 대안을 제공합니다. 벡터에 이상적인 형광 마커를 선택하려면 단색 또는 다색 실험 여부, 형광 단백질의 밝기, 단백질의 성숙 시간, 특정 형광 단백질에서 관찰되는 독성 및 단백질 응집에 대한 표적 세포의 민감도 등 여러 요인에 따라 달라집니다.

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벡터에 drug selection marker 또는 형광 마커를 포함하는 것은 가장 일반적으로 사용되는 접근 방식이지만, drug selection marker와 형광 마커를 모두 포함하는 이중 선택 카세트를 추가하면 양성으로transfection되거나 transduction된 세포를 선택하는데 매우 효율적인 방법을 제공합니다. 그러나 dual-selection cassette의 사용은 바이러스 벡터에서 관찰되는 것처럼 사용 중인 벡터의 제한된 유전자 cargo capacity에 의해 때때로 제한됩니다. VectorBuilder는 실험에 적합한 selection marker를 선택할 수 있는 유연성을 제공하기 위해 다양한 single 및 dual-selection cassette를 제공합니다.

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