VectorBuilder는 바이러스 titer를 어떻게 결정하나요?

바이러스 입자를 채취한 후 만약 바이러스 벡터가 형광 리포터 유전자를 포함하는 경우, 형광 단백질의 발현을 관찰하기 위해 바이러스를 공통 cell line (예: 293T 또는 HEK293)에 transduction하여 바이러스 품질을 먼저 확인합니다. 바이러스 종류에 따라 바이러스의 titer를 정량화하기 위해 다양한 방법을 사용합니다. 간혹 형광 관찰과 정량 측정 사이에 큰 차이가 있을 경우, 제조한 바이러스가 고품질인지 확인하기 위해 재측정 또는 추가 검증을 실시합니다.

Lentivirus

Lentivirus titer를 측정할 때는 p24 ELISA를 사용합니다. 이 방법은 샌드위치 면역측정법을 사용하여 lentivirus supernatants의 HIV-1 p24 core protein 레벨을 측정합니다. Lentivirus 샘플을 우선 anti-HIV-1 p24 capture antibody로 코팅된 microtiter plate에 넣어 lentivirus 샘플에서 p24를 결합합니다. 뒤이어 biotinylated anti-p24 secondary antibody를 추가하면, 결국 플레이트에서 첫번째 항체가 포획한 p24에 결합합니다. 그런 다음 streptavidin-HRP conjugate를 추가하면 streptavidin과 biotin 사이의 상호작용으로 인해 biotinylated anti-p24 antibody에 결합합니다. 그런 다음 substrate solution을 샘플에 첨가하면 HRP와의 상호작용에 따라 발색반응이 일어납니다. 발색 강도는 각 lentivirus 샘플에 존재하는 p24의 양에 비례하여 spectrophotometer를 사용하여 측정한 다음 recombinant HIV-1 p24 standard curve와 비교하여 정확하게 정량합니다. p24 값은 해당 lentivirus 샘플의 바이러스 titer와 밀접한 연관성이 있습니다.

Adenovirus

Adenovirus의 경우 functional titer를 측정합니다. Serially-diluted adenovirus를 HEK293 cell에 transduction한 후, immunocytochemistry 기반 방법을 사용하여 adenovirus-specific hexon protein의 탐지를 통해 성공적으로 transduction된 세포의 수를 세고, 각 immunostained cell은 하나의 감염 단위로 간주됩니다. 대부분의 transduction된 세포가 하나의 바이러스 입자에 의해 각각 감염되도록 하기 위해 매우 낮은 MOI(multiplicity of infection)로 세포에 감염합니다. 이 분석은 기존의 plaque assay와 좋은 상관관계를 보여줍니다. Ultra-purified adenovirus의 경우 바이러스 입자의 optical density (OD260 사용)를 직접 측정하여 titer를 추정하는데, 이는 ultra-purified adenovirus와 functional titer의 optical density 사이에 밀접한 상관관계가 있기 때문입니다. Adenovirus는 안정성이 매우 좋습니다. VectorBuilder의 preparation으로 바이러스 입자들은 모두 살아있고 며칠 동안 상온에서 기능을 유지할 수 있습니다.

AAV (Adeno-associated virus)

용해된 바이러스 입자에서 바이러스 게놈을 직접 추출한 다음 qPCR을 사용하여 스톡에서 바이러스 게놈의 사본 수를 정확하게 정량화하여 AAV의 물리적 역가를 측정합니다 (ITR 영역의 카피 수를 프록시로 사용). AAV 입자는 매우 안정적입니다. 다른 방법(예: ddPCR, TCID50)을 사용한 titer 서비스는 별도 요청시 제공할 수 있습니다.