내 바이러스의 titer는 왜 낮을까요?
당사의 경험에 따르면, 고객이 VectorBuilder에서 바이러스 벡터를 구매했지만 당사의 바이러스 패키징 서비스를 사용하지 않고 스스로 바이러스를 패키징하는 경우, titer가 적정 수준을 밑돌 가능성이 50%가 넘는다. 많은 경우 바이러스 패키징을 직접 수행한 고객들은 당사 벡터의 낮은 titer를 탓했지만, 패키징 서비스를 받은 후에는 벡터가 좋은 titer를 생성할 수 있다는 것을 알게 되었다.
VectorBuilder의 바이러스 패키징 서비스는 폭넓게 최적화된 프로토콜과 많은 독점적 시약과 기술을 채택하여 어려운 벡터의 경우에도 높은 titer, 높은 순도와 일관성을 보장한다. 고객이 직접 패키징을 할 때는 일반적으로 최적화되지 않은 표준 프로토콜을 사용한다. 이는 경험 부족과 결합되어 낮은 titer를 초래할 수 있다. 종종 고객들이 잘못된 packaging cell이나 helper plasmid를 사용하는 실수를 하는 경우가 있다. 예를 들어 일부 고객은 2세대 lentivirus 패키징 시스템을 사용하여 VectorBuilder의 벡터를 패키징하는 실수를 한다(VectorBuilder의 lentivirus 벡터는 모두 3세대임).
개개인의 기술적 숙련도 외에도, 일부 바이러스 벡터는 다양한 이유로 인해 본질적으로 패키징이 어려운 경우가 있다. 가장 흔한 원인 중 하나는 바이러스 벡터가 패키징 세포에 대한 독성이 있는 유전자를 가지고 있어서, 패키징 세포가 죽거나 건강하지 않다는 것이다. 이러한 사례들 중 일부에 대해, VectorBuilder는 독성 유전자 효과를 극복하여 바이러스를 만들 수 있는 독점 기술을 개발하였다. 삽입 절편의 사이즈가 바이러스 패키징 시스템이 감당하기에는 너무 크다는 것도 일반적인 원인이다. 삽입 사이즈를 lentivirus 벡터의 경우 6.4kb, adenovirus 벡터의 경우 8.3kb, AAV 벡터의 경우 4.7kb, MMLV 벡터의 경우 5.5kb로 제한하는 것을 권장한다. 삽입 절편이 위의 권장사항을 초과하면 바이러스 생산을 저해할 수 있다. 또한 당사의 경험에 의하면 바이러스 벡터가 매우 높은 GC 서열(수백 base에 걸쳐 70% 이상)를 함유하고 있는 경우 패키징 효율이 떨어질 수 있다.
적절하게 패키징된 높은 titer의 바이러스도 시간이 지남에 따라 titer가 감소될 수 있다. 특히 lentivirus의 경우에는 -80°C에서 동결하지 않거나 동결-융해 사이클이 반복되면 감염성이 급격히 감소될 수 있다. Adenovirus와 AAV는 훨씬 더 안정적이지만, 만약 오랫동안 냉동 보관하지 않거나 잘못 다뤄진다면 감염성을 잃을 수도 있다.
VectorBuilder의 바이러스 preparation을 사용하는 실험 상황에서 때로는 바이러스 titier가 표시된 것보다 훨씬 낮다는 잘못된 인상을 고객에게 줄 수 있다. 이는 고객이 당사가 titer를 측정하기 위해 사용했던 세포보다 transduction하기 훨씬 어려운 세포에 바이러스를 사용하고 있다면 발생할 수 있다. 또한 고객이 바이러스 벡터에 있는 형광 또는 drug-selection marker를 발현하는 transduction된 세포의 수로부터 titer를 추정하는 일도 자주 발생한다. 형광 또는 drug-selection marker가 silencing 또는 다른 효과로 인해 일부 호스트 세포에서 검출 가능한 수준으로 발현되지 못할 수 있고 또한 하나의 세포가 복수의 바이러스 입자에 의해 감염될 수 있기 때문에, 이러한 방식은 titer가 심각하게 저평가될 수 있다. 이러한 이유로 대규모 transduction 실험을 수행하기 전에 최적의 MOI를 찾기 위해 여러 MOI (multiplicity of infection)에서 목적 세포에 대한 바이러스 preparation을 소규모로 우선 테스트해 보는 것이 중요하다.
당사는 lentivirus, adenovirus, AAV 및 MMLV에 대한 바이러스 패키징 서비스를 제공한다. 당사의 전용 패키징 시약, 패키징 세포와 프로토콜이 바이러스 벡터에 최적화되어 있기 때문에, 패키징 서비스를 선택할 것을 강력히 제안한다. 그 결과 당사는 일반적으로 고객이 직접 실험하는 것보다 더 높은 titer, 더 나은 순도, 더 건강한 바이러스를 생산할 수 있다. 당사의 서비스 가격은 매우 경쟁적이고 고객이 직접 실험하는 것보다 더 경제적이다.
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