CRISPR mediated knockout에 single gRNA 또는 dual gRNA를 사용해야 할까요?

CISPR 매개 게놈 편집의 경우, Cas9 nuclease를 게놈에서 site-specific guide RNA(gRNA)의 타겟 사이트로 유도해 DNA 절단 현상을 만든다. 대부분의 경우 간단한 유전자 knockout을 생성하기 위해 Cas9와 함께 single gRNA를 사용하여 double-strand break (DSB)를 생성할 수 있으며, 이후 non-homologous end joining (NHEJ)에 의해 비효율적으로 수선되어 작은 insertions이나 deletions과 같은 영구적인 돌연변이가 발생한다. 이러한 돌연변이들은 frame-shifts, premature stop codons 등으로 인해 목적 유전자의 loss of function이 발생한다.

Cas9_D10A nickase가 단일 타겟 사이트의 두개의 마주보는 가닥을 타겟으로 사용하는 경우에는 dual gRNA가 사용된다. 이 방식에서 nickase 효소는 두 가닥을 단일 가닥으로 생성하고 두 개의 gRNA 각각에 의해 유도되어, 타겟 사이트에 DSB를 발생시킨다. 일반적으로 이 방법은 DSB가 생성되려면 두 gRNA에 의한 타겟팅이 필요하기 때문에 CRISPR/Cas9 발현의 off-target 효과를 감소시킨다.

Cas9_D10A nickase와 exogenous donor DNA template을 사용하여 목적 유전자에 specific base-changes (예: knockin)를 유도할 때 dual gRNA를 사용할 수 있다. 이 방식에서 두 개의 마주보는 가닥은 원하는 변이 사이트와 인접한 두 사이트에서 2개의 gRNA에 의해 타겟이 될 것이며, homology-directed repair (HDR) pathways로 exogenous donor template을 이용하여 잘라진 서열을 복구하게 된다.

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