게놈 편집을 위해 CRISPR 또는TALEN을 사용해야 할까요?

CRISPR와 TALEN 시스템은 배양 세포와 모델 생물의 게놈을 편집하기 위해 이용되고 있다. 두 시스템 모두 유전자를 knockout하거나, knockin point mutations 또는 insertions하는데 사용될 수 있으나, 이 두 시스템은 여러 면에서 다르며 각각의 장단점이 있다.

Mechanisms
  • CRISPR

    CRISPR 시스템은 site-specific guide RNA(gRNA)를 사용하여 Cas9 nuclease를 게놈의 타겟 사이트로 유도해 DNA를 절단하게 한다. 타겟 서열은 일반적으로 길이가 ~20bp이며, 불일치가 몇개 있는 사이트도 여전히 인식되고 절단될 수 있다.

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  • TALEN

    TALEN 시스템은 각각 FokI nuclease domain과 퓨전된 TAL effector DNA-binding domain (특정 서열 인식)으로 구성된 한 쌍의 chimeric proteins을 사용한다. 이 단백질 쌍은 게놈의 타겟 부위인 각각 ~ 18 bp 및 flanking 14-20 bp spacer를 결합하도록 디자인되었다. DNA에 결합하면, 단백질 쌍의 Fokl nuclease domains은 dimerize될 수 있으며, 이는 두 타겟 사이트 사이의 스페이서 영역 내에서 DNA 절단된다.

Efficiency

CRISPR-, TALEN-mediated 게놈 편집 모두 효율성은 좋지만, 응용 분야, 종, 세포에 따라 효율이 크게 달라진다. 일반적으로 CRISPR는 세포로 전달되어 TALEN보다 DNA 절단을 더 효율적으로 유도할 수 있다.

Off-target effects

CRISPR gRNA는 20 bp의 서열을 타겟으로 하며, TALEN은 총 36 bp의 타겟 서열에 결합된다. 또한 Cas9/gRNA complex는 TALEN보다 서열 불일치(최대 5bp 불일치)에 대한 허용오차가 더 높다. 따라서 TALEN-mediated 절단은 CRISPR보다 specificity가 뛰어나며, TALEN에 의한 게놈의 off-target 절단은 가능성이 낮다. 반면, CRISPR knockout 마우스를 분석한 결과 in vivo에서 off-target 빈도가 더 낮을 것으로 보이지만, cell lins에서는 CRISPR에 대해 off-target 효과가 보고되고 있다. 최근 CRISPR 시스템의 개발은 CRISPR specificity를 크게 향상시켰다. Dual gRNAs 와 함께 Cas9 nickase (Cas9_D10A 및 Cas9 _H840A 등 catalytic nuclease domain을 하나만 포함하는 Cas9 변이체)를 사용하여, 타겟 영역과 근접하게 2개의 single-strand DNA nicks이 생성되고 수선 가능한 타겟 영역 내에서 double-nick DSB (double-strand break)가 발생한다. 이런 디자인에서는 dual gRNAs가 타겟 서열을 최대 40bp 길이로 확장하기 때문에 off-target 효과가 최소화된다.

Target site requirements

TALEN은 게놈에서 거의 모든 서열을 특이적으로 타겟하여 만들어질 수 있다. 반면, CRISPR의 타겟 사이트 선택은 gRNA 타겟 서열의 3' end에 위치한 PAM 서열 (일반적으로 NGG)의 요건으로 제한된다. 이것은 유전자의 어느 곳이라도 절단 가능성이 있기에 유전자를 knockout 하는데 장애가 되지 않지만, 유전자의 특정 위치에서 절단이 필요한 site-specific mutations이나 insertions을 생성하는데 어려움을 줄 수 있다. CRISPR를 사용하여 특정 게놈 사이트를 정밀하게 편집하려면 타겟 사이트의 upstream 및 downstream homology arms에 인접한 원하는 편집 서열을 포함하는 homologous recombination donor vector 또는 긴 올리고를 gRNA 및 Cas9과 함께 세포에 전달하여 타겟 사이트에서 HDR (homology directed repair)-mediated DNA repair를 유도한다.

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간단함 측면에서 보면 CRISPR는 여러 면에서 TALEN보다 우월하다. 첫째, Cas9/gRNA complex의 타겟팅이 단순한 RNA/DNA hybridization에 의존하기 때문에, CRISPR 시스템은 벡터 제작을 위해서 짧은 gRNA만 제작하면 된다. 반면 TALEN 시스템은 각 protein-DNA 상호작용에 고유한 TAL DNA-binding domain의 재조작이 필요하다. 따라서 항상 타겟 사이트당 2개의 벡터가 필요한 TALEN보다 gRNA는 저렴하고 쉽게 디자인하고 제조할 수 있다. 그러나 VectorBuilder 시스템에 있는 TALEN recognition modules은 TALEN 벡터 생성에 필요한 작업을 크게 줄였다. 둘째, mouse embryos 주입과 같은 일부 응용의 경우 Cas9 protein과 gRNA는 직접 주입을 통해 보다 효율적으로 전달될 수 있지만 TALEN은 그렇지 않다. 셋째, 수천 개의 다양한 gRNA를 발현하고 있는 CRISPR screening library를 high-throughput 방식으로 쉽게 제조할 수 있어서 CRISPR는 유전자 스크리닝 실험에 매우 다재다능하다.

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