나의 shRNA는 왜 유전자를 knockdown하지 않을까요?

Not all shRNAs will work

고객들의 경험과 피드백을 기반으로 하면, 보통 임의의 유전자에 대해 3~4개의 shRNA를 테스트할 때, 일반적으로 2~3개는 knockdown에 적정한 결과를 도출된다. 그러나 shRNA를 사용할 때는 모든 shRNA가 작동하지는 않는다는 사실을 인식하는 것이 중요하다. 일반적으로 shRNA의 약 50~70%는 현저한 knockdown 효과가 있으며, 20~30%는 강한 knockdown 효과를 가지고 있다. 특정 유전자를 대상으로 몇개의 shRNA를 시도하면, 뜻밖에도 어느 것도 만족스러운 knockdown을 만들어내지 못할 가능성이 있다. 이런 일이 일어날 때, 가장 좋은 접근법은 특히 문헌 검증을 거친 것으로 더 많은 shRNA를 시도해 보는 것이다. 또한 많은 연구자들은 동일한 유전자를 대상으로 한 shRNA의 "cocktail"(즉, 서로 다른 shRNA의 혼합물)을 사용하며, 이것은 때때로 knockdown 효율을 향상시킬 수 있다.

The assay for validating the knockdown of your gene is not performed properly

shRNA knockdown 효율을 평가하기 위한 가장 일반적이고 민감한 측정법은 RT-qPCR이다. 가끔은 몇 쌍의 프라이머를 시도해보고, 가장 specific하고 효율적인 프라이머를 선택해야 한다. 일반적으로 RT-qPCR 프라이머는 가능하면 게놈 DNA가 증폭되지 않도록 exon-exon junction에 걸쳐야 한다. 새 프라이머를 사용할 때는 아가로즈 젤에 PCR 산물을 전기영동하여 밴드를 확인하거나 시퀀싱으로 PCR 산물을 검증하는 것을 권장한다. 게놈 DNA 오염 정도를 더 잘 평가하기 위해서는 RT-qPCR에서 항상 minus-RT control을 포함시켜야 한다. NCBI 프라이머 디자인 tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)을 사용하여 in silico에서 프라이머의 품질을 검사할 수 있다.

Knockdown 효율은 또한 Western Blot으로 평가될 수 있다. 그러나 Western Blot은 non-specific antibody 결합으로 인해 위양성 밴드가 나오기 쉽고, 이는 knockdown이 없다는 해석으로 잘못 연결될 수 있다. 따라서 사용된 항체가 실제로 목적 유전자에 specific한지 확인하는 것을 주의해야 한다.

The shRNA might only target a subset of transcript isoforms of your gene

shRNA를 디자인할 때 특정 isoform을 knockdown하는 것이 아니면, 가능한 한 많은 transcript isoforms을 타겟으로 하는 것을 일반적으로 권장한다. VectorBuilder는 일반 생물종에 최적화된 shRNA를 포함하는 shRNA 데이터베이스를 구축하였다. VectorBuilder에서 shRNA 벡터를 디자인할 경우, shRNA 컴포넌트를 벡터에 삽입할 때, 당사의 데이터베이스에서 타겟 유전자를 검색할 수 있는 옵션을 보유하고 있다. 그러면 게놈 서열의 컨텍스트에서 이들 shRNA와 모든 transcript isoforms를 볼 수 있는 UCSC Genome Browser 링크를 포함하여 당사가 디자인한 사용 가능한 모든 shRNAs의 상세 정보를 볼 수 있다.

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