Plasmid 정제 수율이 낮은 이유는 무엇일까요?
보유한 plasmid의 복제 origin (origin of replication)이 low-copy replication 입니다.
박테리아 세포당 plasmid 카피 수는 플라스미드의 복제 origin에 의해 결정됩니다. 어떤 origin은 내재적으로 카피 수가 적습니다. Plasmid에 있는 복제 origin의 카피 수를 확인해 봅니다. Low-copy plasmids의 경우, 만족할 만한 DNA 수율을 얻기 위해 plasmid DNA prep용 E. coli 배양량을 증가시킵니다.
Check the copy number of the origin of replication of plasmids supplied by VectorBuilder
Plasmid prep column에 세균 배양액의 양이 너무 적습니다.
Plasmid prep column의 binding capacity를 체크해 보고, plasmid가 high-copy 또는 low-copy plasmid인지 확인합니다. Mini preps의 경우 overnight 박테리아 배양액에서 1~5 ml를 채취하는 것이 좋습니다. Maxi preps의 경우 plasmid가 high-copy plasmid일 경우 overnight 박테리아 배양액에서 100~150 ml를 사용하고, low-copy plasmid일 경우 overnight 박테리아 배양액에서 300~500 ml를 사용하는 것이 좋습니다. 일반적으로 high-copy plasmid의 경우 배양액 1ml로부터 mini prep으로 ~5 ug의 plasmid DNA를 추출할 수 있고, 배양액 150 ml로부터는 maxi prep으로 ~500 ug의 plasmid DNA를 얻을 수 있습니다. Low-copy plasmid (예; pET)의 경우 1ml로부터 1.5~2.5 ug, 150 ml로부터는 150~200 ug의 plasmid DNA를 얻을 수 있습니다.
액체 배양액 중 일부 박테리아에만 plasmid가 포함되어 있습니다.
일부 antibiotics, 특히 ampicillin은 액체 배양에서 빠르게 분해됩니다. 그 결과 plasmid를 함유하지 않은 박테리아가 배양액의 상당 부분까지 번식할 수 있어 plasmid prep의 수율이 매우 낮습니다. 이를 방지하기 위해 사용 전에 ampicillin이 포함된 배지를 새롭게 준비하고 ampicillin이 충분한지 확인합니다. 또한 ampicillin-resistant 박테리아를 배양할 때는 수확 전에 액상 배양액이 너무 오래 포화되지 않도록 합니다. 배양에서 antibiotics 부족 외에도, 오래된 배양에서 plasmid DNA를 추출하면 많은 박테리아 세포가 죽었고 그 안에 들어있는 plasmid DNA도 분해되기 때문에 수율이 낮을 수 있습니다. 따라서 신선한 배양으로 plasmid DNA를 추출하도록 해야 합니다. Plasmid prep을 즉시 수행할 수 없는 경우, 나중에 plasmid prep하기 위해 박테리아를 spin down하고 pellet을 -80°C에 보관 합니다.
E. coli stab culture에서 직접 접종하여 액체배양한 경우
VectorBuilder에서 받은 E. coli liquid stock 또는 stab culture로부터 직접 액체 배양에 접종하면 종종 수율이 낮을 수 있습니다. 우선 적절한 antibiotic이 들어 있는 LB agar plate에 도말한 다음, 그 plate에서 자라는 신선한 colony로 액체 배양액에 접종하는 것을 권장합니다. 자세한 사항은 메뉴 항목 정보 자료 > 문서 자료 > User Instructions > Stab Culture 에서 확인할 수 있습니다.
Plasmid prep kit의 매뉴얼을 주의 깊게 따르지 않았습니다.
Plasmid prep kit를 사용하는 경우 사용 전에 매뉴얼을 주의 깊게 읽어 봅니다. 부적절한 조작이 종종 키트의 성능 저하를 초래할 수 있습니다.
Mini/midi/maxi prep column의 품질이 좋지 않습니다.
일부 브랜드의 plasmid DNA prep columns은 성능이 떨어지고 일관된 결과가 나오지 않을 수 있습니다.