내 plasmid 정제의 수율이 낮은 이유는 무엇일까요?

The origin of replication on your plasmid is for low-copy replication

박테리아 세포당 plasmid 카피 수는 플라스미드의 복제 origin에 의해 결정된다. 어떤 origins은 내재적으로 카피 수가 적다. Plasmid에 있는 복제 origin의 카피 수를 확인해 보자. Low-copy plasmids의 경우, 만족할 만한 DNA 수율을 얻기 위해 plasmid DNA prep용 E. coli 배양량을 증가시킨다.

Check the copy number of the origin of replication of plasmids supplied by VectorBuilder

The volume of bacterial culture is too low for plasmid prep column

Plasmid prep column의 binding capacity를 체크해 보고, plasmid가 high-copy 또는 low-copy plasmid인지 확인한다. Mini preps의 경우 overnight 박테리아 배양액에서 1-5ml를 채취하는 것이 좋다. Maxi preps의 경우 plasmid가 high-copy plasmid일 경우 overnight 박테리아 배양액에서 100~150ml를 사용하고, low-copy plasmid일 경우 overnight 박테리아 배양액에서 300~500ml를 사용하는 것이 좋다. 일반적으로 high-copy plasmid의 경우 배양액 1ml로부터 mini prep으로 ~5ug의 plasmid DNA를 추출할 수 있고, 배양액 150ml로부터는 maxi prep으로 ~500ug의 plasmid DNA를 얻을 수 있다. Low-copy plasmid (예; pET)의 경우 1ml로부터 1.5~2.5ug, 150ml로부터는 150~200g의 plasmid DNA를 얻을 수 있다.

Only a fraction of bacteria in the liquid culture contain plasmids

일부 antibiotics, 특히 ampicillin은 액체 배양에서 빠르게 분해된다. 그 결과 plasmid를 함유하지 않은 박테리아가 배양액의 상당 부분까지 번식할 수 있어 plasmid prep의 수율이 매우 낮다. 이를 방지하기 위해 사용 전에 ampicillin이 포함된 배지를 새롭게 준비하고 ampicillin이 충분한지 확인한다. 또한 ampicillin-resistant 박테리아를 배양할 때는 수확 전에 액상 배양액이 너무 오래 포화되지 않도록 한다. 배양에서 antibiotics 부족 외에도, 오래된 배양에서 plasmid DNA를 추출하면 많은 박테리아 세포가 죽었고 그 안에 들어있는 plasmid DNA도 분해되기 때문에 수율이 낮을 수다. 따라서 신선한 배양으로 plasmid DNA를 추출하도록 해야한다. Plasmid prep을 즉시 수행할 수 없는 경우, 나중에 plasmid prep하기 위해 박테리아를 spin down하고 pellet을 -80°C에 보관한다.

The liquid culture is directly inoculated from E. coli stab culture

VectorBuilder에서 받은 E. coli liquid stock 또는 stab culture로부터 직접 액체 배양에 접종하면 종종 수율이 낮을 수 있다. 우선 적절한 antibiotic이 들어 있는 LB agar plate에 도말한 다음, 그 plate에서 자라는 신선한 colony로 액체 배양액에 접종하는 것을 권장한다. 자세한 사항은 메뉴 항목 Resources  > Documentation > User Instructions > Stab Culture에서 확인할 수 있다.

You have not carefully followed the manual of the plasmid prep kit

Plasmid prep kit를 사용하는 경우 사용 전에 매뉴얼을 주의 깊게 읽어본다. 부적절한 조작이 종종 키트의 성능 저하를 초래할 수 있다.

The mini/maxi prep column is low-quality

일부 브랜드의 plasmid DNA prep columns은 성능이 떨어지고 일관된 결과가 나오지 않을 수 있다.

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