shRNA-매개 knockdown vs CRISPR-, TALEN-매개 knockout의 장단점은?
shRNA-매개 knockdown 또는 nuclease-매개 knockout (예: CRISPR 또는 TALEN)은 세포 배양에 목적 유전자의 loss-of-function 효과를 연구하기 위한 가치 있는 실험 방법이 될 수 있습니다. 어떤 방법이 당신의 특정 용도에 가장 적합한지를 결정하기 위해서, 고려해야 할 몇 가지가 있습니다.
메커니즘
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Knockdown 벡터
Knockdown 벡터는 세포 내에서 분할을 유도하거나 translation을 억제해서 대상 mRNA의 기능을 억제하는 shRNAs (short hairpin RNAs)를 발현합니다. 따라서, shRNA knockdown 벡터는 목적 유전자의 DNA 수준의 서열 변경과는 관련이 없습니다.
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Knockout 벡터
CRISPR와 TALEN은 둘 다 nuclease가 게놈의 특정 타겟 부위를 절단하도록 지시하는 방식으로 작동합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포 기작에 의해 비효율적으로 repaire되며, repaire 부위에서 작은 insertion이나 deletion과 같은 영구적인 돌연변이를 발생합니다. 이러한 돌연변이의 부분집합은 frameshift, premature stop codon 등으로 인해 목적 유전자의 loss of function이 일어날 것입니다. 게놈에서 두 개의 밀접하게 배치된 절단 부위 (몇 kb 이내)를 동시에 대상으로 하는 경우, 이는 또한 끼어있는 부위를 삭제하게 될 것입니다.
유효성
shRNA-매개 knockdown은 타겟 유전자의 발현을 완전히 억제하지는 못할 것입니다. 가장 효과적인 shRNA에도 타겟 유전자의 일부 잔여 발현이 남게 됩니다. 대조적으로, 치료된 세포의 일부에서 CRISPR와 TALEN은 유전자 기능을 완전히 상실하게 하여 영구적인 돌연변이를 발생시킬 수 있습니다.
일관성과 균일성
shRNA 벡터는 일반적으로 처리된 세포의 풀 내에서 세포 간에 높은 균일성과 실험 사이의 매우 일관된 결과를 제공합니다. 반면 CRISPR와 TALEN은 도입된 돌연변이의 확률적 특성 때문에 세포 마다 균일하지 않은 결과를 생성합니다. 세포에서 목적 유전자를 완전히 knockout 하기 위해서는, 세포의 모든 유전자 카피를 knockout 해야 합니다. 정상 세포는 유전자(X- 또는 Y-linked 유전자는 제외)의 2개의 카피를 가지고 있는 반면 암세포는 2개 이상의 카피를 가질 수 있다는 점에서, 그러한 완전한 knockout 세포는 처리된 모든 세포의 극히 작은 일부분일 것입니다. 이 때문에 nuclease-매개 knockout 실험에서는 목적 유전자의 모든 카피가 knockout된 하위 집합을 확인하기 위해 시퀀싱을 통해 클론을 스크리닝해야 합니다.
Off-target 효과
shRNA-매개 knockdown과 nuclease-매개 knockout 모두 off-target 효과가 보고되고 있습니다. Off-target 표현형은 동일한 유전자를 대상으로 복수의 다른 shRNA를 사용하여 추정할 수 있습니다. 복수의 다른 shRNA에 의해 knockdown된 유전자가 일관된 표현형이 된다면, 그것은 off-target 효과에 의해 발생하는 표현형과는 다른 것이라는 것을 보여줍니다. CRISPR-, TALEN-매개 knockout의 경우, off-target 돌연변이로 인해 발생할 수 있는 표현형을 설명하기 위해 loss-of-function 돌연변이를 포함하는 복수의 클론을 분석해야 합니다. 또한 생물정보학적으로 확인된 off-target 사이트는 클론을 시퀀싱하여 해당 사이트가 변이되었는지 확인할 수 있습니다.
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