shRNA-mediated knockdown vs CRISPR-, TALEN-mediated knockout의 장단점은?
shRNA-mediated knockdown 또는 nuclease-mediated knockout (예: CRISPR 또는 TALEN)은 세포 배양에 목적 유전자의 loss-of-function 효과를 연구하기 위한 가치 있는 실험 방법이 될 수 있다. 어떤 방법이 당신의 특정 용도에 가장 적합한지를 결정하기 위해서, 고려해야할 몇가지가 있다.
Mechanisms
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Knockdown vectors
Knockdown 벡터는 세포 내에서 분할을 유도하거나 translation을 억제해서 대상 mRNA의 기능을 억제하는 short hairpin RNAs (shRNAs)를 발현한다. 따라서, shRNA knockdown 벡터는 목적 유전자의 DNA 수준의 서열 변경과는 관련이 없다.
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Knockout vectors
CRISPR와 TALEN은 둘 다 nucleases가 게놈의 특정 타겟 부위를 자르도록 지휘함으로써 기능한다. 그런 다음 이러한 절단은 세포 기작에 의해 비효율적으로 수선되며, 수선 부위에서 작은 insertions이나 deletions과 같은 영구적인 돌연변이를 발생한다. 이러한 돌연변이의 부분집합은 frame-shifts, premature stop codons 등으로 인해 목적 유전자의 loss of function이 일어날 것이다. 게놈에서 두 개의 밀접하게 배치된 절단 부위(몇 kb 이내)를 동시에 대상으로 하는 경우, 이는 또한 끼어있는 부위를 삭제하게 될 것이다.
Effectiveness
shRNA-mediated knockdown은 타겟 유전자의 발현을 완전히 억제하지는 못할 것이다. 가장 효과적인 shRNA에도 타겟 유전자의 일부 잔여 발현이 남게 된다. 대조적으로, 치료된 세포의 일부에서 CRISPR와 TALEN은 유전자 기능을 완전히 상실하게 하여 영구적인 돌연변이를 발생시킬 수 있다.
Consistency and uniformity
shRNA 벡터는 일반적으로 처리된 세포의 풀 내에서 세포 간에 높은 균일성과 실험 사이의 매우 일관된 결과를 제공한다. 반면 CRISPR와 TALEN은 도입된 돌연변이의 확률적 특성 때문에 세포 마다 균일하지 않은 결과를 생성한다. 세포에서 목적 유전자를 완전히 knockout 하기 위해서는, 세포의 모든 유전자 카피를 knockout해야 한다. 정상 세포는 유전자(X- 또는 Y-linked 유전자는 제외)의 2개의 카피를 가지고 있는 반면 암세포는 2개 이상의 카피를 가질 수 있다는 점에서, 그러한 완전한 knockout 세포는 처리된 모든 세포의 극히 작은 일부분일 것이다. 이 때문에 nuclease-mediated knockout 실험에서는 목적 유전자의 모든 카피가 knockout된 하위 집합을 확인하기 위해 시퀀싱을 통해 클론을 스크리닝해야 한다.
Off-target effects
shRNA-mediated knockdown과 nuclease-mediated knockout 모두 off-target 효과가 보고되고 있다. Off-target 표현형은 동일한 유전자를 대상으로 복수의 다른 shRNA를 사용하여 추정할 수 있다. 복수의 다른 shRNA에 의해 knockdown된 유전자가 일관된 표현형이 된다면, 그것은 off-target 효과에 의해 발생하는 표현형과는 다른 것이라는 것을 보여준다. CRISPR-, TALEN-mediated knockout의 경우, off-target 돌연변이로 인해 발생할 수 있는 표현형을 설명하기 위해 loss-of-function 돌연변이를 포함하는 복수의 클론을 분석해야 한다. 또한 생물정보학적으로 확인된 off-target 사이트는 클론을 시퀀싱하여 해당 사이트가 변이되었는지 확인할 수 있다.
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