Eureka Moments at the Bench | Apr 26, 2023

성공을 위한 세팅: PCR에 적합한 주형이 있는지 어떻게 확신합니까?

내가 대학원생이었을 때 우리는 실험실의 PCR 기계를 "Magic Box"라고 불렀습니다. 우리가 안에 넣은 시약이 우리가 찾고 있던 것과 정확히 일치하거나, 전혀 예상하지 못한 것을 생성하거나, 전혀 생성하지 못했기 때문입니다. 제대로 반응이 일어나지 않으면 변경해야 할 사항을 정확히 말하기 어려운 경우가 많았습니다. 프라이머였나? 주형? 그날 신고 있던 신발?

Magic Box에서 일어나는 일을 이해하면 성공적인 PCR 실험을 설계할 수 있으며 이 기사에서는 VectorBuilder에서 배운 몇 가지 팁을 자세히 설명하고자 합니다.

"시작"을 누르면 일어나는 일

PCR(Polymerase Chain Reaction)은 과학자들이 단시간에 엄청난 수의 DNA단편을 복제할 수 있게 해주기 때문에 분자생물학 실험실의 표준입니다. 세포나 동물에 DNA가 도입될 수 있도록 DNA단편을 플라스미드에 효율적으로 ligation하는 데 DNA 양은 중요합니다. PCR은 유전형 분석, 유전자 발현 정량화, COVID19와 같은 병원체 검출을 포함하여 수 많은 응용 분야를 가지고 있습니다.

DNA의 특정 서열을 증폭하기 위해 반응에는 증폭할 주형, 목적유전자의 5' 및 3' 말단에 상보적인 프라이머, 뉴클레오티드, Mg2+ 포함 염, 및 DNA polymerase 가 필요합니다. 모든 것이 순조롭게 진행될 때 반응 튜브가 기계에 들어가면 마법 같은 일이 일어납니다.

Figure 1. Polymerase Chain Reaction (PCR) 단계

타겟 DNA는 약 95°C에서 변성되어 DNA의 상보적 가닥을 함께 유지하는 수소 결합이 끊어집니다. 그런 다음 프라이머가 상보적인 DNA 서열에 결합하는 어닐링 온도, 일반적으로 약 50-60°C로 떨어집니다. 마지막으로 DNA 중합효소는 한 번에 하나씩 상보적인 뉴클레오티드를 추가하면서 확장을 통해 새로운 상보적 가닥을 형성합니다. 첫 번째 cycle 후 새로 만들어진 상보 가닥은 프라이머가 결합하는 추가 주형 역할을 할 수 있어 기하급수적 증폭이 가능합니다(Figure 1). 약 1시간 후 PCR 튜브는 동일하게 보이지만 내부 세계의 구성은 크게 다릅니다.

PCR 반응 후의 후속 실험 계획은 사용할 시약과 PCR 유형을 결정하는 데 매우 중요한 요소입니다. 유전자 발현을 검사하고 있습니까? 샘플에 유전자 또는 병원체가 존재하는지 확인하고 계십니까? 유전자 기능을 연구하기 위해 돌연변이를 도입합니까? 차세대 시퀀싱을 수행할 예정입니까?

광범위한 PCR 주형과 응용분야

PCR의 가장 간단한 예 중 하나는 DNA 주형(플라스미드 또는 게놈 DNA)을 사용하여 검출 또는 복제를 위해 단편을 증폭하는 것입니다. 이것은 특정 대립유전자 또는 유전자가 게놈 샘플에 존재하는지 확인하거나 플라스미드로 클로닝하기 위해 단편을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 플라스미드 주형은 세포 및 조직에서 유전자 발현을 시각화할 수 있는 돌연변이 유발 또는 in situ hybridization probe 합성과 같은 후속 프로세스에 사용할 수 있습니다. 차세대 시퀀싱(NGS)을 준비하기 위해 이러한 실험에 특수화된 프라이머를 사용할 수 있습니다.

게놈DNA 주형은 정량PCR(qPCR, or real-time PCR)을 통한 정량 실험에도 사용할 수 있습니다. 이를 통해 예를 들어 대장균 오염을 감지할 때 특정 주형서열의 양이나 복제 수를 결정할 수 있습니다. qPCR에서 프로브는 이중 가닥 DNA가 형성될 때 형광을 내며 증폭을 실시간으로 추적하고 원래 서열을 정량화합니다.

RNA가 주형으로 사용될 때 PCR 과정의 일부로 역전사(RT)가 일어나야 RT-PCR이 됩니다. 이것만으로는 cDNA 라이브러리 준비, 또는 코딩 서열의 클로닝과 같은 상대적으로 제한된 응용 분야가 있습니다. 특정 유전자에 대해 total RNA나 mRNA를 cDNA로 역전사시킨 후 각각 시퀀싱, 스크리닝 또는 플라스미드로 클로닝할 수 있습니다.

종종 RNA를 주형으로 사용할 때 정량 PCR의 첫 번째 단계는 역전사입니다. RT-qPCR은 RNAi 검증, 바이러스 역가 결정, COVID-19에서 암에 이르는 질병 검출을 포함한 유전자 발현의 정량화를 가능하게 합니다.

다음 표는 다양한 PCR 접근법에서의 몇 가지 차이점을 보여줍니다.

	PCR	qPCR	RT-PCR	RT-qPCR
Typical template	DNA (plasmid or genomic)	DNA (genomic)	RNA	RNA
Product	DNA	DNA	cDNA	cDNA
Quantifiable	No	Yes	No	Yes
Application	Detection of gene/allele; cloning	Detection of level of DNA pathogens; detection of copy number of genes	cDNA library synthesis; cloning of coding sequence	Detection of level of gene expression

PCR이 잘못되었을 때

PCR 반응에 사용되는 각각의 시약은 이론적 그리고 경험적으로 최적화되어야 합니다. 반응에서 아무 결과도 나오지 않거나 예상치 못한 밴드가 나타나는 경우 어떤 시약이나 설정을 변경해야 하는지 결정하기 어려울 수 있습니다.

일반적으로 고려해야 하는 첫 번째 변수는 프라이머와 어닐링 온도입니다. 프라이머가 타겟 서열에 대한 높은 특이성, 적절한 GC 함량(40-55%), 반복 서열 적고, 2차 구조 형성 없이 설계되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 프라이머에는 이론적인 어닐링 온도가 있지만 다양한 어닐링 온도로 반응을 실행하고 gel에서 분석하여 경험적으로 최적화해야 할 수도 있습니다. 또한 시퀀싱과 같은 후속 실험을 용이하게 하기 위해 추가 뉴클레오티드가 프라이머에 추가되는 경우 프라이머 및 어닐링 조건도 종종 최적화시켜야 합니다.

PCR 실험을 설계할 때 주형도 고려해야 합니다. 예를 들어 플라스미드는 원형DNA보다는 프라이머와 polymerase가 더 쉽게 접근할 수 있도록 DNA를 선형화해야 하며 농도와 순도를 최적화해야 합니다.

아래 표에는 PCR 반응의 다양한 구성 요소에 대한 가이드라인이 나와 있습니다.

	Primers	Template	Mg²⁺
Design/Input	Specific to target 40-55% GC content No repetitive sequences or secondary structures	Ensure correct type (see previous table) Ensure high purity - 260/280 ratio of 1.8 for DNA and 2.0 for RNA, and high integrity of RNA	Check compatibility with 2+ DNA polymerase for source (MgCl₂ vs MgSO₄)
PCR Setup	Annealing temp- 3-5°C below recommended Annealing time- decrease for higher specificity	Denaturation temp/ time - higher for higher GC content template Extension time - longer for longer fragments Extension temp - lower for longer fragments	Consider reaction components (EDTA and increased dNTPs require higher Mg²⁺)
Concentration	0.05-1 uM	Plasmids: 0.1-1 ng Genomic/library DNA: 5-50 ng	1-4 mM

PCR이 일어나지 않고, 약하거나 비특이적인 밴드가 생성되고, 프라이머와 어닐링 온도가 최적화된 경우, 주형, 프라이머, cycle 수 등 모든 것을 늘리고 싶을 수 있습니다. 그러나 라이브러리 DNA와 같은 복잡한 주형을 이용할 때 수백, 수천 개의 서로 다른 분자의 상호 작용은 매우 예측할 수 없으며 cycle이 너무 많거나 주형이 너무 많으면 가짜산물이 생성되고 목적유전자가 비효율적으로 증폭될 수 있습니다. 결국, 반응은 증폭의 기하급수적 단계를 통과하고, 프라이머는 고갈되고, 변성된 DNA는 약하거나 비특이적 밴드로 나타날 수 있는 heteroduplex 구조를 형성할 수 있습니다. 비특이적 밴드는 일부 짤린 주형으로 인해 형성될 수도 있습니다. 이러한 더 짧은 단일가닥DNA가 상보적인 단일가닥 DNA에 결합할 수 있으며 자체적으로 프라이머 역할을 하여 잘못된 PCR 산물을 형성할 수도 있습니다.

Magic Box는 의심할 여지없이 놀라움으로 가득 차 있습니다. 수 많은 혁신, 의약품 및 치료는 PCR 없이는 불가능합니다. 맞습니다. 겉으로 보기에는 기본적으로 보이는 이 과정이 어려운 난관이 될 수도 있습니다. 그러나 VectorBuilder의 방대한 경험을 통해 당신의 클로닝과 라이브러리 프로젝트에 해결책을 드리겠습니다.

Sources

Grace Adams; A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond). 2020 June;42 (3): 48–53. doi: 10.1042/BIO20200034

Canene-Adams K. General PCR. Methods Enzymol. 2013;529:291-8. doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00024-0. PMID: 24011055.

Hatcher SL, Lambert QT, Teplitz RL, Carlson JR. Heteroduplex formation: a potential source of genotyping error from PCR products. Prenat Diagn. 1993 Mar;13(3):171-7. doi: 10.1002/pd.1970130304. PMID: 8506218.

Hou Y, Zhang H, Miranda L, Lin S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PLoS One. 2010 Mar 5;5(3):e9545. doi: 10.1371/journal.pone.0009545. PMID: 20221433; PMCID: PMC2832698.

Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73. doi: 10.1101/sqb.1986.051.01.032. PMID: 3472723.

Weising K, Atkinson RG, Gardner RC. Genomic fingerprinting by microsatellite-primed PCR: a critical evaluation. PCR Methods Appl. 1995 Apr;4(5):249-55. doi: 10.1101/gr.4.5.249. PMID: 7580910.