유전자 유도 발현 솔루션Inducible Gene Expression Solutions

VectorBuilder는 tetracycline에 의하여 조절되는 유전자 발현을 위한 Tet에 의해 유도되는 유전자 발현 시스템의 포괄적인 컬렉션을 제공합니다. 실험 목적에 맞게 non-viral, viral 및 transposon backbone으로 광범위한 pre-made 및 custom-made 벡터를 제공합니다. 모든 주요 바이러스 유형 (예: 렌티바이러스, AAV, 아데노바이러스) 으로 다양한 titer 스케일로 패키징하여 Tet 시스템 구성 요소들을 transfection이 어려운 세포에 전달할 수 있습니다. 또한 tetracycline 또는 그 유사체 (예: doxycycline) 에 의하여 고객이 원하는 유전자 (GOI)를 효율적이며 신뢰할 수 있는 유도 발현을 할 수 있는 Tet 에 의해 유전자의 발현이 유도되는 안정한 세포주를 제작해드릴 수도 있습니다.

서비스 중점 사항
  • All-in-one 및 이중 벡터 형태로 제공 가능
  • 최소한의 누출 발현으로 강력한 유도를 달성하기 위하여 tTS/rtTA fusion cassette를 진정한 온-오프 스위치로 사용
  • 비타겟 조직에서 최소한의 누출 발현이 가능한 low-leak tissue-specific 벡터
  • 100% 서열 검증, 짧은 소요시간 및 경쟁력 있는 가격
  • 실험 설계, 데이터 분석 및 문제 해결을 위한 강력한 기술 지원

서비스 세부 사항

맞춤형 Tet 벡터

VectorBuilder는 tetracycline에 의해 유도되는 유전자 발현 cassette를 타겟 세포로 효율적으로 전달하기 위한 다양한 맞춤형 벡터를 제공합니다. 매우 직관적인 온라인 벡터 디자인 플랫폼을 사용하여 다양한 벡터 backbone (non-viral, viral 또는 transposon) 컬렉션과 벡터 컴포넌트 (promoters, ORFs, 형광 및 항생제 선별 markers)의 무제한 조합으로, Tet에 의해 조절되는 원하는 유전자 (GOI) 의 발현을 위한 맞춤형 벡터를 디자인할 수 있습니다.

Plasmid DNA 정제 및 바이러스 패키징은 custom Tet 벡터를 shopping cart에 추가할 때, downstream 서비스에서 구매할 수 있습니다.

Design tips 
  • TRE에 의하여 GOI를 발현하는 벡터와 Tet 조절 단백질 발현 벡터는 all-in-one Tet 벡터가 아닙니다. Tet에 의해 조절되는 유전자 발현을 위해서는, TRE promoter에 의한 GOI 발현과 Tet 조절 단백질의 발현이 같은 세포 내에서 일어나야 합니다.
  • 2세대 Tet 시스템에서는, TRE promoter가 사용되며 이는 rtTA, tTS, tTA 등과 같은 Tet 조절 단백질들과 상호작용합니다. 3세대 Tet 시스템에서는, TRE3G promoter와 이에 해당하는 Tet3G Tet 조절 단백질이 함께 사용됩니다.
  • 이중 벡터 시스템을 디자인할 때에는 TRE에 의하여 GOI를 발현하는 벡터와 Tet 조절 단백질을 발현하는 벡터를 위하여 서로 다른 두 가지의 marker를 선택하여야 합니다. 실험 시스템에서 사용하는 세포주에 항생제 내성 유전자가 있는 경우처럼 이미 marker가 포함되어 있으면, Tet 벡터의 marker와 양립할 수 있는지를 확인하여야 합니다.
Choose your custom Tet vectors View more
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많이 사용되는 Tet 벡터

VectorBuilder는 all-in-one 및 이중 벡터 형태로 많이 사용되는 Tet 벡터 패널을 제공합니다. Plasmid DNA 정제 및 바이러스 패키징은 Tet 벡터를 shopping cart에 추가할 때 downstream 서비스에서 구매할 수 있습니다.

아래의 벡터 picker를 사용하여 많이 사용되는 Tet 벡터를 주문할 수 있습니다.

Selection tips 
  • TRE에 의하여 GOI를 발현하는 벡터와 Tet 조절 단백질 발현 벡터는 all-in-one Tet 벡터가 아닙니다. Tet에 의해 조절되는 유전자 발현을 위해서는, TRE promoter에 의한 GOI 발현과 Tet 조절 단백질의 발현이 같은 세포 내에서 일어나야 합니다.
  • tTA, tTS 또는 rtTA를 안정적으로 발현하는 세포주 제작을 위해서 Tet 조절 단백질 발현 벡터를 선택하시기 바랍니다.

All-in-one (Tet-on)

Note: All-in-one (Tet-on) 렌티바이러스 벡터를 원하시면, 디자인 의뢰하기에서 요청해주시기 바랍니다.

TRE에 의한 GOI 발현

Tet 조절 단백질 발현

위의 벡터 picker에서 원하시는 벡터를 찾을 수 없는 경우, 디자인 의뢰하기에서 원하시는 내용을 요청해주시면 당사의 과학자들이 도와드릴 것입니다.

Tet 벡터를 위한 바이러스 패키징

VectorBuilder는 Tet에 의해 유도되는 유전자 발현 시스템을 transfection이 어려운 세포에 전달하기 위한 다양한 스케일의 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스에 대한 우수한 품질의 바이러스 패키징 서비스를  제공합니다. 당사의 자체적인 기술과 시약으로 titer, 순도, 생존력 및 일관성 측면에서 바이러스 패키징 방법을 크게 개선했습니다. 당사의 패키징 방법은 벡터 제작 서비스에 사용되는 바이러스 벡터 시스템을 위해서도 최적화되어 있습니다. 그 결과 클로닝 및 바이러스 패키징에 대한 고객의 요구를 만족시킬 수 있는 서비스를 제공함으로써 당사에 반복적으로 제작을 의뢰하는 고객들이 점점 많아지고 있습니다.

렌티바이러스 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일 View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >4x108 TU/ml >108 TU/ml 250 ul (10x25 ul) $399 8-16 days
Medium >3x108 TU/ml 1 ml (10x100 ul) $599
Large >2x109 TU/ml >109 TU/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x109 TU/ml >109 TU/ml 500 ul (10x50 ul) $1,299
Ultra-purified large 1 ml (10x 100 ul) $1,599

TU = Transduction units (also known as infectious units)

AAV 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >1012 GC/ml >2x1011 GC/ml 250 ul (10x25 ul) $399 10-18 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $599
Large >5x1012 GC/ml >2x1012 GC/ml 1 ml (10x100 ul) $999
Ultra-purified pilot Cell culture & in vivo >2x1013 GC/ml >1013 GC/ml 100 ul (4x25 ul) $1,299 16-26 days
Ultra-purified medium 500 ul (10x50 ul) $1,899
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,999

GC = Genome copies

아데노바이러스 패키징 서비스의 가격, 소요 시간 및 스케일 View more
Scale Application Typical Titer Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >2x1010 IFU/ml >1010 IFU/ml 250 ul (10x25 ul) $599 27-39 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $999
Large >2x1011 IFU/ml >1011 IFU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,599
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >2x1012 VP/ml >1012 VP/ml 500 ul (10x50 ul) $1,999 29-43 days
Ultra-purified pilot 1 ml (10x100 ul) $2,399

IFU = Infectious units; VP = Virus particles

바이러스 패키징 서비스에 대한 자세한 정보를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

Tet에 의해 유도되는 유전자 발현을 위한 안정한 세포주

VectorBuilder는 최소의 백그라운드 발현과 GOI의 높은 유도 발현이 가능한 Tet에 의해 유도되는 유전자 발현을 위한 안정한 세포주를 맞춤형으로 제작할 수 있습니다. 또한, 유연한 실험 디자인 및 신뢰할 수 있는 유전자 유도 발현를 위하여 tTS/rtTA 를 발현하는 세포주를 제작할 수 있으며, 이들은 TRE promoter에 의해 발현되는 GOI를 가진 plasmid/바이러스로 transfection/transduction 될 수 있습니다. 안정한 Tet-On 세포주에서 GOI의 유도 발현은 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 또한 최종 세포주를 출하하기 위해서는 무균 테스트 및 mycoplasma 검출과 같은 일련의 표준 QC 분석이 수행됩니다.

Tet에 의해 유도되는 유전자 발현을 위한 안정한 세포주 제작 서비스를 위한 가격 및 소요 시간 View more
Stable Cell Line Model Strategy Deliverable Price (USD) Turnaround
tTS/rtTA Expressing Stable Cell Line Lentivirus-based Pooled Cells From $2,199 7-9 weeks
3 Single Clones From $4,199 9-15 weeks
Tet-On Gene Expression Stable Cell Line Lentivirus-based Pooled Cells From $3,599 10-16 weeks
3 Single Clones From $5,899 13-21 weeks

안정한 세포주 제작 서비스에 대한 자세한 정보를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.

기술적인 정보

Tetracycline에 의해 유도되는 유전자 발현

Tetracycline 유도 유전자 발현 시스템은 포유류 세포에서 유전자 발현의 타이밍을 제어하는 ​​강력한 도구입니다 (Figure 1). 당사는 GOI 발현이 매우 특이적이면서 tetracycline 농도에 따라 발현 수준이 조절되는 Tet-On 및 Tet-Off 시스템을 모두 제공합니다.

당사의 Tet-On 벡터 시스템은 tetracycline이 없을 때는 GOI가 거의 완전히 발현이 억제되도록 하고, tetracycline을 넣어주면 강력하고 신속한 발현이 일어나도록 디자인되었습니다. 이는 tetracycline이 없을 때는 tTS 단백질에 의한 능동적인 발현 억제가 일어나도록 하고, tetracycline이 있을 때는 rtTA 단백질에 의한 강력한 promoter 활성화에 의한 발현이 일어나도록 하는 멀티컴포넌트 시스템을 통해 달성됩니다. Tetracycline이 없을 때, TetR (Tet repressor 단백질)과 KRAB-AB (Kid-1 단백질의 transcriptional repressor domain)의 융합으로 만들어진 tTS 단백질이 TRE promoter에 결합하여 transcription을 능동적으로 억제합니다. 반면에 rTetR (변형 Tet repressor)과 VP16 (HSV virion protein 16 의 transcription activator domain)의 융합으로 만들어진 rtTA 단백질은 TRE promoter에 결합하여 tetracycline이 존재할 때만 transcription을 활성화합니다. 당사의 Tet-Off 벡터 시스템은 tTA 단백질과 TRE promoter의 결합에 의해 유전자가 발현되는 상태에 있다가, tetracycline에 의하여 tTA 단백질이 TRE promoter로부터 분리되면서 발현이 멈추는 원리를 이용하여 타겟 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있습니다.

Figure 1. Tet-On 및 Tet-Off 시스템들을 이용한 Tet에 의해 조절되는 유전자 발현 매커니즘. Dox: doxycycline (tetracycline 유사체)

Tet에 의해 유도되는 유전자 발현 시스템은 아래 표에 요약된 것과 같이 다른 시스템에 비해 여러 가지 장점을 제공하기 때문에 많이 사용되고 있습니다.

Tet Inducible Gene Expression System Other Inducible Gene Expression Systems
Regulation Minimized leaky expression in the absence of tetracycline. High levels of leaky expression in the absence of inducer due to basal transgene expression. E.g. Tamoxifen-based system, riboswitch-based system.
Gene induction level Achieves rapid and high levels (1000-fold) of target gene induction in the presence of tetracycline. Achieves much lower levels (100-fold) of target gene induction. E.g. Tamoxifen-based system, riboswitch-based system.
Reversibility Can achieve reversible gene expression by the addition and removal of tetracycline. Results in irreversible activation of gene expression. E.g. Tamoxifen-based system.
Toxicity High level induction can be achieved with non-toxic levels of doxycycline. Exhibits increased cellular toxicity. E.g. Tamoxifen-based system.
Cost-effective Requires tetracycline or one of its derivatives such as doxycycline which are cheap and easily available. Requires inducers which are more expensive. E.g. hormone-based systems.
Pleiotropic effects Minimized pleiotropic effects due to the absence of prokaryotic regulatory sequences in mammalian cells. Increased pleiotropic effects due to activation of non-target endogenous genes. E.g. Ecdysone-based system, CID-based system.
All-in-one 또는 이중 벡터 디자인

Tetracycline에 의해 조절되는 GOI의 발현 유도 또는 억제를 달성하려면, 타겟 세포에서 TRE promoter에 의해 발현되는 GOI와 Tet 조절 단백질 (tTA, tTS 또는 rtTA) 이 동시에 발현되어야 합니다. 이는 동일한 벡터에서 GOI 및 Tet 조절 단백질을 모두 발현하거나 (all-in-one 벡터), GOI 및 Tet 조절 단백질 발현을 위해 별도의 벡터를 사용하여 (이중 벡터) 할 수 있습니다. All-in-one 벡터 사용의 장점은 단일 벡터를 사용하여 Tet에 의해 조절되는 유전자 발현에 필요한 모든 요소들을 세포에 전달할 수 있어서 기술적으로 간단한다는 점입니다. GOI 및 Tet 조절 단백질을 함께 발현하기 위해 별도의 벡터를 사용하면, 두개의 개별 plasmid/바이러스를 사용하여 타겟 세포에 co-transfection/co-transduction해야 하는데, 모든 세포가 plasmid/바이러스로 동시에 transfection/transduction되는 것은 아니기 때문에 기술적인 어려움이 있을 수 있습니다. 이중 벡터를 사용하기 위한 또다른 방법은 Tet 조절 단백질을 안정적으로 발현하는 세포 또는 개체에 원하는 GOI를 가진 plasmid/바이러스로  transfection/transduction하는 것입니다. 그러나 이 방법은 상당한 시간과 노력이 들 수 있습니다. 이러한 기술적인 어려움에도 불구하고, 이중 벡터 시스템은 동일한 Tet 조절 단백질을 발현하는 plasmid, 바이러스 또는 세포주를 여러 다른 GOI를 발현하는 plasmid/바이러스와 함께 사용할 수 있다는 유연성을 제공하기 때문에 때때로 선호되기도 합니다.

조직 특이적인 Tet에 의해 유도되는 유전자 발현

VectorBuilder는 GOI의 조직 특이적 유도 발현을 달성하기 위한 표준 및 low-leak의 두가지 형태의 all-in-one (Tet-On) 벡터를 제공합니다. 표준 Tet-On 벡터 시스템은 사용자가 선택하는 조직 특이적 promoter에 의해 tTS와 rtTA를 융합 단백질로 발현되는 반면에, low leak Tet-On 벡터 시스템은 ubiquitous promoter를 사용하여 tTS를 발현하며 조직 특이적 promoter를 사용하여 rtTA를 발현합니다. Low leak 디자인은 tetracycline이 없을 때는 타겟이 아닌 조직에서의 누출 발현을 최소화하고, tetracycline이 존재할 때 타겟 transgene의 조직 특이적인 발현이 유도되도록 하는 장점이 있습니다.

VectorBuilder 웹사이트의 "정보 자료"> "학습 센터"에는 Tet에 의해 유도되는 유전자 발현 실험을 성공적으로 계획, 실행 및 문제 해결하는데 도움이 될 수 있는 풍부한 자료가 있습니다.

Tet에 의해 발현이 유도되는 벡터 시스템에 대한 가이드를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다.
Tet 벡터 구성 요소들에 대한 가이드를 원하시면 여기를 눌러주시기 바랍니다. 
문서 자료
사용 설명서

자주 묻는 질문

Tet-On 벡터 시스템에서 rtTA와 tTS/rtTA 중에서 어느 쪽을 선택해야 할까요?

rtTA만 사용하는 Tet-On 시스템은 대개 inducer가 없을 때 상당한 수준의 누출 발현이 일어납니다. 이와 달리 tTS/rtTA를 발현하는 당사의 Tet-On 벡터 시스템은 유전자 발현 조절을 위한 진정한 tetracycline에 의해 조절되는 온-오프 스위치로서 inducer가 없을 때의 발현을 최소화하고, tetracycline에 의한 민감하면서도 매우 역동적인 발현 유도를 제공합니다 (Figure 2). Tetracycline이 없을 때, tTS 단백질은 TRE promoter에 결합하여 능동적으로 유전자의 transcription을 저해함으로써 발현을 최소화합니다. 반대로 rtTA 단백질은 tetracycline이 있을 때만 TRE promoter에 결합하여 유전자의 transcription을 활성화합니다.

- Dox+ Dox

rtTA

Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image

tTS/rtTA

Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image

Figure 2. EGFP와 rtTA를 발현하는 all-in-one (Tet-On) 벡터 (Top) 및 EGFP와 tTS/rtTA를 발현하는 all-in-one (Tet-On) 벡터 (Bottom) 를 각각 293T세포에 transfection한 후 EGFP의 발현을 관찰한 결과입니다. EGFP의 발현을 doxycycline을 처리하지 않은 경우 (-Dox) 와 처리한 경우 (+Dox) 에 대하여 transfection 48시간 후에 관찰한 결과입니다.

Tet 시스템 구성 요소들을 전달하기 위하여 렌티바이러스를 사용하려면, all-in-one과 이중 벡터 디자인 중에서 어느 쪽을 선택해야 할까요?

Tet 시스템의 요소들을 렌티바이러스로 전달하는 경우, 일반적으로 all-in-one 벡터 디자인은 추천하지 않습니다. 당사의 내부적인 결과와 고객들의 의견에 따르면, all-in-one 렌티바이러스 벡터의 유전자 유도 발현의 효율은 상황에 따른 편차가 크며, 종종 만족스럽지 못한 것으로 보입니다. All-in-one 벡터는 일반적으로 TRE promoter에 의해 유도되는 GOI와 Tet 조절 단백질 (tTA, tTS 또는 rtTA) 을 위한 두개의 유전자 발현 cassette로 구성되어 있습니다. 하나의 렌티바이러스 벡터가 여러 개의 유전자 발현 cassette를 갖는 경우에, 적절한 바이러스 패키징을 위하여 요구되는 조건과 각각의 cassette의 독립적인 발현을 위하여 요구되는 조건이 상충함으로써 문제가 되는 경우가 때때로 있습니다. 렌티바이러스 벡터의 두 LTR 사이에 polyadenylation signal이 존재하게 되면 바이러스 패키징을 방해하기 때문에, polyadenylation signal이 허용되지 않습니다. 그 결과 upstream promoter에 의한 transcription이 upstream ORF의 끝에서 멈추지 않고 downstream promoter와 ORF까지 계속되기도 하며, 이는 종종 부분적이지만 downstream ORF의 발현을 저해하기도 합니다. All-in-one 렌티바이러스 벡터에서 Tet 조절 단백질은 GOI의 downstream에 위치하기 때문에, 이들의 발현이 크게 감소하면서 누출 발현이 일어나게 하고 inducer에 의한 발현 유도가 비효율적으로 일어나도록 합니다 (Figure 3).

- Dox+ Dox

All-in-one

Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image

Dual

Inducible Tet-on vector transfection image Inducible Tet-on vector transfection image

Figure 3. 이중 (Tet-On) 렌티바이러스 (Top) 또는 all-in-one (Tet-On) 렌티바이러스 (Bottom) 를 각각 293T세포에 transduction한 후 EGFP의 발현을 관찰한 결과입니다. 이중 벡터에 의한 발현 유도를 위해서는 tTS/rtTA를 안정적으로 발현하는 293T 세포에 TRE에 의해 EGFP가 발현되는 렌티바이러스를 transduction하였습니다. EGFP의 발현을 doxycycline을 처리하지 않은 경우 (-Dox) 와 처리한 경우 (+Dox) 에 대하여 transduction 48시간 후에 관찰한 결과입니다.

어떤 벡터 시스템을 사용해야 될까요?

모든 성공적인 실험 디자인을 위해서 가장 중요한 요소들 중 하나가 타겟 세포로 GOI를 전달하기 위한 벡터 시스템을 선택하는 것입니다. 다양한 바이러스 및 바이러스가 아닌 벡터 옵션들이 있기 때문에 실험 디자인을 위한 이상적인 벡터를 선택하기 위해서는 여러 가지 요소들을 고려해야 합니다. 몇몇 중요한 고려사항들은 다음과 같습니다: 타겟 세포가 transfection이 쉬운가, 어려운가? 단기적인 발현을 원하는가, 아니면 호스트 유전체 내로의 안정한 결합을 원하는가? GOI의 발현을 위한 맞춤형 promoter를 사용해야 하는가? 벡터를 세포 배양에서 사용할 것인가, 아니면 in vivo에서 사용할 것인가? 조건에 따른 발현 또는 유도에 의한 발현을 원하는가? GOI가 얼마나 큰가?

아래의 표에는 일반적으로 사용되는 벡터 시스템과 실험 디자인을 위하여 선택을 할 때 고려해야 할 중요한 사항들이 있습니다.

Regular Plasmid Vectors Viral Vectors Transposon-based Vectors
Transfection-based Yes No Yes
Transient expression or stable integration Transient Stable integration Stable integration
Requires packaging No Yes No
Cargo capacity Large Small to medium Medium to large
Primary use Cell culture Cell culture & In vivo Cell culture & in vivo
Promoter customization Yes Depending on viral vector type Yes