BAC Recombineering

Bacterial artificial chromosomes (BAC)은 E. coli에서 최대 300Kb의 큰 DNA 인서트를 클로닝하고 안정적으로 유지하는데 적합한 DNA 벡터이다. BAC은 BAC recombineering으로 알려진 상동 재조합 기반 유전공학 기술을 사용하여 원하는 변형을 수행하기 위해 상대적으로 쉽고 빠르게 유 전자를 조작할 수 있다.

VectorBuilder는 BAC의 regulatory sequences 뒤에 리포터를 위치하고, 타겟 유전자에 point mutations을 도입하고, BAC의 부위를 plasmid로 옮기고, BAC 백본에 drug-selection 또는 시각화 마커를 추가하는 등 다양한 BAC 변형 서비스를 제공한다. 디자인 의뢰하기에실험 목적을 기술하여 보내 주시면 BAC modification 전략을 설계하고 BAC 주문부터 최종 변형된 BAC 클론 생성 및 검증까지 서비스하고 있다.

Service Details

Price and turnaround

BAC recombineering 프로젝트의 비용과 소요시간은 관련된 작업량으로 인해 상대적으로 높다. 그러나 아웃소싱하는 것은 여전히 직접 하는 것 보다 훨씬 경제적이고 빠르다. 절차의 복잡성과 오류가 발생하기 쉬운 특성으로 인해 대부분의 연구자들이 직접 시도하면 시약 구매, 프로토콜 학습 및 문제 해결에 최대 1년이 소요될 수 있다. 고객은 가설을 세우거나 실험을 설계하는데 시간을 투자하고, 지루한 클로닝 작업은 아웃소싱하면 된다. 사용 가능한 BAC recombineering 서비스의 개요는 Table 1에 나와 있으며 가격 및 소요시간은 아래 Table 2에 나와 있다.

Table 1. Overview of BAC recombineering services.

Available Services Price (USD) Turnaround Note
Knockin
EGFP, mCherry, LacZ, GCaMP6s, Luciferase, DTR $2,999 42-63 days Drug-selection cassette used in one-step BAC modification is removed.
$4,098 63-84 days Drug-selection cassette used in one-step BAC modification is removed; piggyBac ITRs are added to BAC backbone.
Cre, CreERT2 $7,179 98-119 days Drug-selection cassette used in one-step BAC modification is removed. LoxP sites on BAC backbone are removed. piggyBac ITRs can be added to BAC backbone.
Custom DNA fragment Please inquire.
Point mutation
Custom point mutation $5,599 49-77 days Two-step BAC modification.
$6,698 70-98 days Two-step BAC modification; piggyBac ITRs are added to BAC backbone.
Removal of loxP sites on BAC backbone
pBACe3.6 $4,480 63-84 days The loxP and loxP511 sites on pBACe3.6 backbone may interact with Cre to cause unwanted recombination in the genome. piggyBac ITRs can be added to BAC backbone.
Other BAC cloning vectors Please inquire.
Transfer fragment from BAC to plasmid
pStart-K $2,999 35-49 days Typically, the transferred fragment should not exceed 30 kb. pStart-K-ITR plasmid backbone has piggyBac ITRs.
pStart-K-ITR
Other plasmids Please inquire.
Add visualization markers or other elements to BAC backbone*
Neo, Puro, piggyBac ITRs $1,399 35-42 days These elements are added to the loxP site on BAC backbone.
Other elements Please inquire.

*This service is available only for BACs that contain a loxP site in their backbones. Most BACs from the BACPAC Resource Center contain loxP sites.

Table 2. Breakdown of price and turnaround for BAC recombineering services.

Service Price (USD) Turnaround
Design BAC modification strategy Free 1-4 days
Obtain BAC from vendor $300 2 weeks
One-step BAC modification (without removing drug-selection cassette) From $2,090* 2-4 weeks
Optional: Remove drug-selection cassette used in one-step BAC modification $350 1-2 weeks
Two-step BAC modification From $5,099* 4-8 weeks
Add drug-selection or visualization marker to BAC backbone** From $1,099 1-2 weeks
Transfer region of BAC onto plasmid $2,699 2-4 weeks
Validation of modified BAC Free 1 week

*Price may vary depending on the complexity of the sequence being introduced.

**This service is available only for BACs that contain a loxP site on their backbones. Most BACs from the BACPAC Resource Center contain loxP sites.

Design BAC modification strategy

VectorBuilder의 숙련된 과학자 팀은 고객이 필요로 하는 BAC modification을 실현하기 위한 상세하고 매우 효과적인 전략을 무료로 제공한다!

Obtain BAC from vendor

필요한 BAC의 ID 번호를 아는 경우, 이 번호만 알려 주면 구매를 대행한다. 어떤 BAC을 사용해야 할지 모르는 경우, 연구하고자 하는 유전자에 따라 적합한 BAC을 찾는다. 대부분의 BAC은 CHORI의 BACPAC Resource Center에서 구할 수 있지만, 일부 BAC은 다른 공급 업체에서 구해야 한다. 고객이 BAC을 E. coli stock 으로 당사로 보내는 것도 가능하다.

Validation of modified BAC

BAC의 변형된 영역은 시퀀싱에 의해 확인한다. BAC은 반복 서열의 존재로 인해 때때로 결실될 수 있다. 이러한 가능성을 줄이기 위해, 변형된 BAC을 다시 형질전환하여 단일 클론을 얻고, 전체 BAC에서 여러 사이트의 PCR 증폭을 수행하여 주요 결실이 있지 않았는지 확인한다.

Deliverables

BAC recombineering 서비스의 최종 결과물은 변형 및 검증된 BAC이 포함된 E. coli stock 이다. Miniprep (> 10ug), Midiprep (> 100ug), Maxiprep (> 300ug), Megaprep (> 1mg) 및 Gigaprep (> 10mg)의 여러 스케일의 고품질 BAC DNA를 추가로 구입할 수 있다.

Customer-supplied materials

고객이 BAC을 제공하는 경우, "서포트"> "시료 제출 양식"에서 시료 정보를 제출하세요. 시료의 지연이나 손상을 방지하기 위해 가이드라인을 엄격히 따라 주세요. 고객이 제공한 시료는 VectorBuilder의 필수 QC를 거쳐 샘플 당 $ 120부터 시작하는 추가 QC 비용이 발생할 수 있다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지 생산을 시작하지 않는다.

Technical Information

Advantages and applications of BACs

일반 plasmid 벡터를 사용하는 것이 세포 배양 및 동물에 타겟 유전자를 발현하기 위한 표준이자 가장 일반적인 접근 방식이지만, 이러한 벡터의 적용은 때때로 30Kb에 불과한 DNA 서열을 운반하는 능력에 의해 제한된다. 반면 BAC은 E. coli에서 최대 300 Kb의 큰 DNA 인서트를 클로닝하고 안정적으로 유지하는 데 적합하다. BAC은 E. coli의 fertility (F) factor plasmid를 기반으로 하여 박테리아 세포 당 BAC 한 카피를 유지하는데 도움이 되므로, rearrangements에 덜 민감하여 높은 카피 수 plasmid에 비해 더 안정적이다. 대부분의 BAC은 BACPAC Resource Center, Arabidopsis Resource Center, The Sanger Institute 및 INRA BAC-YAC Resource Center와 같은 다양한 생물자원센터와 특정 상업 자원에서 쉽고 저렴하게 얻을 수 있다. 이러한 BAC은 BAC recombineering을 사용하여 원하는 변형을 수행하기 위해 비교적 쉽고 빠르게 유전자를 조작할 수 있다.

BAC은 큰 DNA 조각에 안정성을 부여할 수 있는 능력과 용이한 조작성으로 인해 인간, 마우스 및 Arabidopsis thaliana를 포함한 여러 모델의 게놈 시퀀싱 프로젝트에 널리 사용되었다. BAC의 다른 일반적인 응용에는 질병 관련 유전자의 positional cloning을 위한 BAC library 스크리닝, 다양한 질병 및 분자 경로에서의 기능 연구를 위해 야생형, 돌연변이 또는 리포터 태그 버전의 유전자 또는 regulatory elements 를 운반하는 BAC을 보유한 형질전환 세포주 또는 형질전환 마우스 제작이 포함된다. Herpesvirus 와 같은 DNA 또는 RNA 바이러스의 게놈을 운반하는 감염성 BAC 클론을 제작하고 이러한 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환을 연구한다.

One-step BAC modification

BAC modification은 유전자 발현을 추적하기 위해 유전자의 promoter 뒤에 reporter를 배치하는 것과 같은 주요 서열 변화(Figure 1) 또는 point mutation과 같은 작은 변화(Figure 2)를 도입하여 사용될 수 있다.

주요 변화의 경우(Figure 1) LacZ 또는 GFP reporter 등 목적 유전자(GOI)가 들어있는 DNA 절편에 FRT 사이트에 인접한 drug-selection cassette (flanking homology regions과 함께)를 더하여, homologous recombination을 통해 BAC의 내인성 영역을 대체하는데 사용한다. Drug-selection cassette는 성공적으로 수정된 BAC 클론의 확인을 용이하게 한다. 그리고 이 cassette는 뒤에 하나의 FRT 사이트를 남겨두고 Flp-mediated recombination에 의해 제거된다.

Figure 1. Schematic representation of one-step BAC modification for introducing a gene of interest (GOI) such as LacZ or GFP reporter behind the promoter of a gene.

Point mutation (Figure 2)의 경우, 변이 부위를 포함한 DNA 절편에 FRT 사이트에 인접한 drug-selection cassette(인접 homology 영역과 함께)를 더한 것을, homologous recombination을 통해 해당 내인성 영역을 대체하는데 사용한다. 이 cassette는 뒤에 하나의 FRT 사이트를 남겨두고 Flp-mediated recombination에 의해 제거된다. BAC이 원하는 point mutation에 더하여 남아있는 FRT를 운반하기 때문에, 남아있는 FRT는 "scar" 서열로 간주된다. 유전자 기능에 영향을 주지 않기 위해 scar 서열은 intron이나 UTR과 같이 유전자의 비기능 영역에 위치해야 한다.

Figure 2. Schematic representation of one-step BAC modification for introducing a point mutation in the first exon of a gene along with an FRT scar sequence in the downstream intron.

Two-step BAC modification

FRT scar 서열을 남기지 않고 BAC에 point mutation과 같은 작은 변화를 도입하기 위해 two-step modification 방법을 사용한다(Figure 3). 이 방식은 남아있는 FRT scar 서열에 대한 원하는 변이의 부근에 자리가 없을 때 one-step 방식보다 선호된다. Two-step BAC modification이 선호되는 예는 수정될 유전자가 매우 큰 single-exon 유전자일 때, 그리고 원하는 point mutation이 유전자의 중간에 있을 때이다. 따라서 point mutation 근처에 scar 서열을 남길 수 있는 자리가 없다. Two-step 방법은 적절한 drug-selection cassette를 사용한 positive selection과 negative selection에 의존한다(Figure 3). 첫번째 단계에서, 이 cassette는 positive selection에 의해 가능하게 된 homologous recombination을 통해 타겟 영역을 대체하는데 사용된다. 두번째 단계에서 cassette는 negative selection에 의해 가능하게 된 homologous recombination을 통해 원하는 변이를 포함하는 최종 서열로 추가 대체된다.

Figure 3. Schematic representation of two-step BAC modification for introducing a point mutation in a large single-exon gene without leaving behind any scar sequence.

Add drug-selection or visualization marker to BAC backbone

Neomycin resistance과 같은 drug-selection marker 또는 EGFP와 같은 visualization marker를 BAC backbone에 추가할 수 있다. 대부분의 BAC은 backbone에 loxP 사이트를 포함하고 있다. 이 사이트들은 관심 마커를 발현하는 cassette를 삽입하는 데 사용될 것이다. 세포가 이와 같이 수정된 BAC으로 감염되었을 때, BAC backbone에 마커가 있으면 BAC으로 성공적으로 transfection된 세포의 selection이나 visualization을 가능하게 할 수 있다. 이는 drug selection에 의해 안정적으로 통합된 BAC을 포함하는 세포를 분리하는데 특히 유용하다.

Transfer region of BAC onto plasmid

BAC의 특정 영역을 plasmid로 옮기면 인접 서열의 영향없이 해당 영역을 연구할 수 있다. 예를 들어, 전체 BAC을 사용하여 BAC에서 유전자의 기능을 연구하기 위해 형질전환 마우스를 만드는 경우 동일한 BAC에 있는 다른 유전자가 존재하면 발생된 표현형의 해석을 혼동시킬 수 있다. Plasmid에 유전자를 분리하고 plasmid를 사용하여 형질전환 마우스를 만드는 것은 이런 문제를 회피하는 데 도움이 된다. 추가적인 장점은 plasmid와 BAC을 사용하여 작업할 수 있는 기술적 용이성이다. BAC의 모든 영역 (최대 60kb)을 plasmid로 옮길 수 있다.

How to Order

FAQ

What are the advantages of using BACs over YACs?

While both BACs and YACs are suitable for cloning large DNA fragments and even though YACs offer a larger cargo carrying capacity (up to 3000 Kb) compared to BACs (up to 300 Kb), BACs are typically preferred over YACs due to the following reasons: 1) BACs are more stable compared to YACs and therefore, help to maintain the integrity of large genomic DNA fragments. Using YACs for cloning large genomic DNA inserts often leads to the loss or rearrangements of DNA segments during propagation, thereby yielding erroneous end-products consisting of non-contiguous segments of the genome; 2) YACs exhibit significantly high levels (40-60 %) of chimerism caused by recombination between two YAC fragments or two YACs within the host yeast cells. Presence of such chimeric effects limits the use of YACs in various applications including contig assembly, chromosome walking and functional analysis of intact genes; 3) BACs can be propagated easily and rapidly in bacterial host cells and purified efficiently using standard DNA purification techniques like any other standard plasmid. YACs on the other hand are required to be propagated in and purified from yeast cells which is technically more challenging and time-consuming. Additionally, yeast cells typically yield considerably low amounts of YAC DNA upon purification.

Why are BACs preferred over standard expression plasmids for generating transgenic mice?

The ability of BACs to carry large DNA fragments allows large genomic DNA inserts including distant regulatory elements to be cloned into BACs. In contrast, standard expression plasmids can carry only the cDNA corresponding to the transgene of interest due to their limited cargo carrying capacity. The ability to include all regulatory elements associated with a given transgene within a BAC helps achieve optimal expression of the transgene, both spatially and temporally in transgenic animals harboring the BAC which is typically unachievable with a regular expression plasmid carrying only the transgene.