BAC DNA 재조합 (BAC Recombineering)

Bacterial artificial chromosomes (BAC)은 E. coli에서 최대 300Kb의 큰 DNA을 클로닝하고 안정적으로 유지하는데 적합한 DNA 벡터입니다. BAC은 BAC 재조합으로 알려진 상동 재조합 기반 유전공학 기술을 사용하여 원하는 변형을 도입하기 위해 비교적 쉽고 빠르게 유전자를 조작을 할 수 있습니다.

VectorBuilder는 BAC의 발현 조절 부위 다음에 리포터 넣기, 타겟 유전자에 점 돌연변이 (point mutation) 도입하기, BAC의 일부를 plasmid로 옮기기, BAC backbone에 항생제 선별 또는 시각화를 위한 마커를 추가하기 등의 다양한 BAC 변형 서비스를 제공합니다. 디자인 의뢰하기에서 실험 목적을 기술하여 보내 주시면, BAC 변형 전략을 설계하고 BAC 주문부터 최종 변형된 BAC 클론 생성 및 최종 검증까지 서비스하고 있습니다.

서비스 세부 사항

가격 및 소요 시간

BAC 재조합 프로젝트의 비용과 소요시간은 관련된 작업량으로 인해 상대적으로 높습니다. 그러나 당사에 아웃소싱하는 것은 여전히 직접 하는 것 보다 훨씬 경제적이고 빠릅니다. 실험 절차의 복잡성과 오류가 발생하기 쉬운 특성으로 인해 대부분의 연구자들이 직접 시도하는 경우 시약 구매, 프로토콜 학습 및 문제 해결에 최대 1년이 소요될 수 있습니다. 그 대신에 고객은 가설을 세우거나 실험을 설계하는데 시간을 투자하시고, 지루한 클로닝 작업은 당사에 맡겨주시면 됩니다. 사용 가능한 BAC 재조합 서비스의 개요는 Table 1에 나와 있으며, 비용과 소요시간은 아래의 Table 2에 나와 있습니다.

Table 1. BAC 재조합 서비스의 개요.

Available Services Price (USD) Turnaround Note
Knockin
EGFP, mCherry, LacZ, GCaMP6s, Luciferase, DTR $2,999 42-63 days 한단계 BAC 변형을 위한 항생제 선별 카세트는 최종적으로 제거됩니다.
$4,098 63-84 days 한단계 BAC 변형을 위한 항생제 선별 카세트는 최종적으로 제거됩니다. piggyBac ITR들을 BAC backbone에 추가합니다.
Cre, CreERT2 $7,179 98-119 days 한단계 BAC 변형을 위한 항생제 선별 카세트는 최종적으로 제거됩니다. BAC backbone의 LoxP 부위들은 제거됩니다. piggyBac ITR들을 BAC backbone에 추가할 수 있습니다.
Custom DNA fragment 문의하시기 바랍니다.
Point mutation
Custom point mutation $5,599 49-77 days 두단계 BAC 변형으로 됩니다.
$6,698 70-98 days 두단계 BAC 변형으로 됩니다. piggyBac ITR들을 BAC backbone에 추가합니다.
Removal of loxP sites on BAC backbone
pBACe3.6 $4,480 63-84 days pBACe3.6 backbone에 있는 loxP, loxP511 서열들은 Cre와 작용하여 유전체 내에 원치 않는 재조합을 일으킬 수 있습니다. piggyBac ITR들을 BAC backbone에 추가할 수 있습니다.
Other BAC cloning vectors 문의하시기 바랍니다.
Transfer fragment from BAC to plasmid
pStart-K $2,999 35-49 days 이 가격은 전달되는 DNA 조각의 크기가 30 kb 미만일 때의 가격입니다. 30 kb 이상의 조각을 전달하는 경우 가격이 올라갈 수 있습니다. pStart-K plasmid backbone은 60 kb (또는 그 이상)의 크기를 가진 insert를 수용할 수 있습니다. pStart-K-ITR backbone은 insert 주위로 PiggyBac ITR이 있어서 PiggyBac에 의해 유전체 내로 삽입될 수 있도록 해줍니다.
pStart-K-ITR
Other plasmids 문의하시기 바랍니다.
Add visualization markers or other elements to BAC backbone*
Neo, Puro, piggyBac ITRs $1,399 35-42 days 이들 구성 요소들은 BAC backbone의 loxP 부위에 추가됩니다.
Other elements 문의하시기 바랍니다.

* 이 서비스는 backbone에 loxP 부위가 있는 BAC에만 가능합니다. BACPAC Resource Center에서 온 BAC들은 대부분 loxP site들을 가지고 있습니다.

Table 2. BAC 재조합 서비스의 가격 및 소요 시간에 대한 세부 내역

Service Price (USD) Turnaround
Design BAC modification strategy 무료 1-4 일
Obtain BAC from vendor $300 2 주
One-step BAC modification (without removing drug-selection cassette) > $2,090* 2-4 주
Optional: Remove drug-selection cassette used in one-step BAC modification $350 1-2 주
Two-step BAC modification > $5,099* 4-8 주
Add drug-selection or visualization marker to BAC backbone** > $1,099 1-2 주
Transfer region of BAC onto plasmid $2,699 2-4 주
Validation of modified BAC 무료 1 주

* 이 비용은 도입하는 서열의 복잡한 정도에 따라서 차이가 있을 수 있습니다.

** 이 서비스는 backbone에 loxP 부위가 있는 BAC에만 가능합니다. BACPAC Resource Center에서 온 BAC들은 대부분 loxP site들을 가지고 있습니다.

BAC 변형 전략 설계

VectorBuilder의 숙련된 과학자들이 고객이 필요로 하는 BAC 변형을 실현하기 위한 상세하고 매우 효율적인 전략을 무료로 제공합니다!

공급 업체로부터 BAC 확보

필요한 BAC의 ID 번호를 아는 경우, 이 번호만 알려 주시면 당사에서 구매를 대행합니다. 어떤 BAC을 사용해야 할지 모르는 경우, 연구하고자 하는 유전자에 대한 적합한 BAC을 찾아 드립니다. 대부분의 BAC은 CHORI의 BACPAC Resource Center에서 구할 수 있지만, 일부 BAC은 다른 공급 업체에서 구해야 한다. 고객이 BAC을 E. coli stock 으로 당사로 보내시는 경우 이 단계는 생략될 수 있습니다.

변형된 BAC 확인

BAC의 변형된 부분은 DNA sequencing에 의해 확인합니다. BAC은 반복 서열의 존재로 인해 때때로 부분적으로 소실될 수 있습니다. 이러한 가능성을 줄이기 위해, 변형된 BAC을 다시 형질전환하여 단일 클론을 얻고, 전체 BAC의 여러 부분들을 PCR 증폭을 수행하여 주요한 부분들이 소실되지 않았음을 확인합니다.

결과물

BAC 재조합 서비스의 최종 결과물은 변형 및 검증된 BAC으로 제공됩니다. Miniprep (> 10ug), Midiprep (> 100ug), Maxiprep (> 300ug), Megaprep (> 1mg) 및 Gigaprep (> 10mg)의 여러 스케일의 정제된 고품질 BAC DNA를 추가로 구입할 수 있습니다.

고객에 의하여 제공되는 BAC

고객이 BAC을 제공하는 경우, "서포트"> "시료 제출 양식"에서 시료 정보를 제출해주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며, 아이템 유형 및 용도에 따라 항목당 $120 이상의 추가 QC 요금이 발생할 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다.

기술적인 정보

BAC의 장점 및 응용 분야

일반 plasmid 벡터를 사용하는 것이 세포 배양 및 동물에서 타겟 유전자를 발현하기 위한 표준이자 가장 일반적인 접근 방식이지만, 이러한 plasmid 벡터들은 때때로 최대 30Kb에 불과한 DNA 서열 운반 능력에 의해 제한됩니다. 반면에 BAC은 E. coli에서 최대 300 Kb의 큰 DNA 인서트를 클로닝하고 안정적으로 유지하는 데 적합합니다. BAC은 박테리아 세포당 한 copy의 BAC만 유지하도록 해주는 E. coli의 fertility (F) factor plasmid를 기반으로 하기 때문에, 재배열이 일어날 가능성이 적어서 copy 수가 높은 plasmid에 비해 더 안정적입니다. 대부분의 BAC은 BACPAC Resource Center, Arabidopsis Resource Center, The Sanger Institute 및 INRA BAC-YAC Resource Center와 같은 다양한 생물자원센터와 몇몇 상업 자원에서 쉽고 저렴하게 얻을 수 있습니다. 이러한 BAC들은 BAC 재조합을 사용하여 원하는 변형을 수행하기 위해 비교적 쉽고 빠르게 유전자 조작을 할 수 있습니다.

BAC은 큰 DNA 조각에 안정성을 부여할 수 있고 용이한 조작이 가능한 덕분에 인간, 생쥐 및 Arabidopsis thaliana를 포함한 여러 모델 생물들의 유전체 시퀀싱 프로젝트에 널리 사용되어 왔습니다. 그밖의 BAC이 이용되는 일반적인 응용 분야는 다음과 같습니다. 질병 관련 유전자의 positional cloning을 위하여 BAC library를 이용하여 스크리닝할 수 있습니다. 다양한 질병 및 molecular pathway에서의 기능 연구를 위헤서 야생형, 돌연변이 또는 리포터가 부가된 유전자 또는 발현 조절 서열을 포함하는 BAC을 형질전환된 세포주 또는 생쥐의 제작에 이용합니다.

1-단계 BAC 변형

BAC 변형은 유전자 발현을 추적하기 위해 유전자의 promoter 다음에 reporter를 배치하는 것과 같은 주요 서열 변화 (Figure 1) 또는 점 변이 (point mutation)과 같은 작은 변화 (Figure 2) 를 도입하기 위하여 사용될 수 있습니다.

주요 변화의 경우 (Figure 1) LacZ 또는 GFP reporter 등의 목적 유전자(GOI)와 함께 양쪽에 FRT 사이트가 있는 drug-selection cassette를 포함하는 DNA 서열의 양쪽에 homology region들을 배치한 DNA 조각을 사용하여 상동재조합 (homologous recombination)을 통해 BAC 내의 영역을 대체하는데 사용합니다. 항생제 선별 (drug-selection) cassette는 성공적으로 변형된 BAC 클론의 확인을 용이하게 합니다. 그리고 이 cassette는 Flp에 의한 재조합으로 하나의 FRT 사이트만 남기고 제거됩니다.

Figure 1. 원하는 유전자의 promoter 다음에 LacZ나 GFP reporter를 도입하는 1-단계 BAC 변형의 개요.

점 변이 (point mutation, Figure 2) 의 경우, 변이 부위를 포함하는 서열과 함께 양쪽에 FRT 사이트가 있는 drug-selection cassette를 포함하는 DNA 서열의 양쪽에 homology region들을 배치한 DNA 조각을 사용하여 상동재조합 (homologous recombination)을 통해 BAC 내의 영역을 대체하는데 사용합니다. 이 cassette는 Flp에 의한 재조합으로 하나의 FRT만 남기고 제거됩니다. 이 남아 있는 FRT는 원하는 변이와 함께 BAC내에 남게 되기 때문에 "흉터"와 같은 서열로 생각될 수 있으며, 유전자의 기능에 영향을 주지 않기 위해 intron이나 UTR과 같이 유전자의 기능과 상관없는 영역에 위치하도록 디자인을 해야 합니다.

Figure 2. 원하는 유전자의 첫번째 exon에 점 변이와 함께 downstream intron에 "흉터" 서열이 남도록 하는 1-단계 BAC 변형의 개요.

2-단계 BAC 변형

FRT 흉터 서열을 남기지 않고 BAC에 점 변이와 같은 작은 변화를 도입하기 위해 2-단계 변형 방법이 사용됩니다 (Figure 3). 이 방식은 원하는 변이의 부근에 FRT 흉터 서열을 위한 자리가 없는 경우에 한 단계 변형 방식보다 선호됩니다. 두 단계 BAC 변형이 선호되는 한 예는 변형될 유전자가 매우 큰 single-exon 유전자이면서 원하는 점 변이가 유전자의 중간에 있어서 점 변이 근처에 흉터 서열을 남길 수 있는 자리가 없는 경우입니다. 두 단계 변형 방법은 적절한 항생제 선별 cassette를 사용한 positive/negative selection에 의해서 이루어집니다 (Figure 3). 첫번째 단계에서, 이 cassette는 positive selection으로 상동재조합을 통해 타겟 영역을 대체하는데 사용됩니다. 삽입된 cassette는 두번째 단계에서 원하는 변이를 포함하는 최종 서열과 상동재조합을 통해 대체되어 negative selection으로 원하는 BAC 변형을 만들 수 있습니다.

Figure 3. 원하는 유전자에 "흉터" 서열을 남기지 않고 큰 single-exon에 점 변이를 도입하는 2-단계 BAC 변형의 개요.

BAC backbone에 항생제 선별 또는 시각화를 위한 마커 추가

Neomycin 저항성과 같은 항생제 선별 marker 또는 EGFP와 같은 visualization marker를 BAC backbone에 추가하면 BAC이 transfection된 세포를 쉽게 선별하거나 관찰할 수 있습니다. 특히 항생제 선별을 통하여 BAC이 세포의 유전체에 안정하게 결합된 세포를 분리하는데 유용합니다. 대부분의 BAC은 backbone에 loxP 사이트를 포함하고 있어서 이 사이트들을 이용하여 이들 marker를 발현하는 cassette를 BAC에 삽입할 수 있습니다.

BAC의 일부를 plasmid에 옮기기

BAC의 특정 영역을 plasmid로 옮기면 인접한 서열들에 의한 영향이 없이 해당 영역을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 전체 BAC을 사용하여 BAC에서 유전자의 기능을 연구하기 위해 형질전환 마우스를 만드는 경우, BAC에 다른 유전자가 존재하면 결과의 해석을 혼동시킬 수 있습니다. Plasmid에 원하는 유전자를 분리하고 plasmid를 사용하여 형질전환 마우스를 만드면 이런 문제를 피하는 데 도움이 됩니다. BAC에 비할 때 추가적인 장점은 plasmid를 사용할 때의 기술적인 용이성입니다. 당사에서는 BAC의 어떠한 영역 (최대 60kb) 이든 plasmid로 옮길 수 있습니다.

주문 방법

자주 묻는 질문

YAC과 비교할 때 BAC의 장점은 무엇입니까?

BAC과 YAC 둘 다 큰 DNA 조각을 클로닝하는데 적합합니다. YAC은 BAC이 갖는 최대 300 kb의 적재량에 비하여 최대 3000 kb의 훨씬 큰 적재량을 가지고 있지만, 다음과 같은 여러 가지 이유 때문에 BAC이 YAC에 비해 선호됩니다. 1) BAC은 YAC에 비하여 더 안정하기 때문에 큰 유전체의 DNA를 안정하게 보존할 수 있습니다. YAC을 사용하여 큰 유전체 DNA를 클로닝하는 경우 종종 증식하는 중에 DNA 서열의 손실이나 재배열이 일어날 수 있어서 실제 유전체 내에서 인접하지 않은 부분들이 연결되어 구성된 잘못된 최종 산물이 얻어지곤 합니다. 2) YAC은 종종 호스트 효모 세포 내에서 YAC들 간에 일어나는 재배열에 의하여 상당한 수준의 (40-60 %) chimerism이 일어나는 것을 볼 수 있습니다. 이러한 chimerism으로 인해서 YAC은 유전자의 contig assembly, chromosome walking, functional analysis 등에 이용하는데 있어 제약이 됩니다. 3) BAC은 박테리아 호스트를 사용하여 쉽고 빠르게 증식이 가능하며, 일반적인 DNA 정제 방법들을 사용하여 효율적인 정제가 가능합니다. 반면에 YAC은 효모 세포를 이용하여 증식하고 정제되어야 하므로 기술적인 요구도가 높고 시간이 많이 걸립니다. 또한 효모 세포로부터 정제되는 YAC의 수율은 일반적으로 상당히 낮습니다.

Transgenic mice를 만드는데 있어서 일반적인 발현용 plasmid에 비해 BAC이 선호되는 이유가 무엇입니까?

큰 DNA 조각을 적재할 수 있는 BAC은 유전자에서 거리가 멀리 떨어진 regulatory element를 포함하는 큰 DNA 조각을 클로닝할 수 있지만, 일반적인 발현용 plasmid는 제한된 적재능력에 의하여 GOI만 적재할 수가 있습니다. 이러한 BAC의 regulatory element까지 포함하여 적재할 수 있는 능력 덕분에 원하는 유전자로 transgenic animal을 만들었을 때 유전자가 적절한 장소 (조직, 기관 등) 와 시간에 발현되도록 할 수 있으며, 이는 유전자만을 포함하는 plasmid 벡터에 의해서는 이루어질 수 없는 일입니다.