AAV Biodistribution Profiling

재조합 adeno-associated virus (AAV)는 최근 광범위한 유전자 치료 및 백신 응용 분야에서 널리 사용되는 유전자 전달 벡터이다. AAV 벡터의 치료 가능성 및 안전성 프로파일을 평가할 때 반드시 고려해야할 사항은 다양한 기관 및 조직에서의 분포 및 지속성이다.

일반적으로 사용되는 AAV serotype에 대한 일부 biodistribution 연구가 보고되었지만, 이는 적절하지 않다. 기존 연구는 일반적으로 하위 기관 수준에서 다른 세포 유형을 조사하지 않고 기관 수준 해상도로 제한된다. 또한 일반적으로 다른 투여 경로를 조사하지 않고 정맥 주입에 ​​중점을 둔다. 중요한 것은 대부분의 연구가 설치류에 대해 수행되었기 때문에 인간과 고도의 진화 및 생리학적 차이가 그 데이터를 인간에게 추론할 수 있는지에 대해 심각한 의심을 제기하고 있다. 또한 새로 개발된 많은 천연 및 합성 serotype은 biodistribution 데이터가 전체적으로 부족하다. 이러한 문제를 복잡하게 하는 것은 동일한 serotype으로 패키징된 다른 벡터 서열이 다른 transgene이 선천적 면역을 포함한 다른 세포 반응을 유발할 수 있기 때문에, 여전히 다른 biodistribution을 가질 수 있다는 가능성이다.

VectorBuilder에서 제공하는 AAV biodistribution profiling서비스는 이러한 모든 문제를 극복하고 가장 적합한 종에서 고해상도 데이터를 얻을 수 있도록 도와준다. 특히 주목할만한 것은 인간이 아닌 영장류(NHP, non-human primates)에서 biodistribution profiling을 수행할 수 있는 능력이다. 아래에 설명된 대로 VectorBuilder는 가장 포괄적인 AAV biodistribution 연구를 제공할 수 있다.

Service Highlights

  • Full-service platform: VectorBuilder는 모든 AAV 전임상 및 임상 CRO 및 CDMO 니즈에 대한 원스톱 솔루션을 제공할 수 있는 세계 유일의 회사이다. 당사의 AAV 서비스에는 vector 디자인 및 optimization, vector cloning, virus packaging, capsid evolution 및 targeted engineering, AAV biodistribution profiling 및 GMP 제조가 포함된다.
  • Multiple species including nonhuman primate (NHP): in vivo biodistribution연구에서 mouse, rat, 그리고 중요하게는 두가지 비인간 영장류 종인 crab-eating macaque (Macaca fascicularis, 일명 cynomolgus monkey)와 rhesus macaque (Macaca Mulatta)와 같은 다양한 종을 제공한다. 연구는 고도로 훈련된 전문가에 의해 AAALAC 인증 시설에서 수행된다.
  • Multiple analytical assays: 형광 리포터의 영상화, flow sorting에 의한 형광 양성 세포의 분리, luciferase 리포터 활성의 정량화, qPCR에 의한 genome copy number분석, RT-qPCR에 의한 GOI 발현 분석 등을 포함하여 기관, 조직 및 세포 수준에서 AAV biodistribution 을 조사하기 위한 다양한 분석을 수행할 수 있다.
  • Multiplexing analysis using barcode and NGS: 많은 전임상 AAV 파이프라인은 추가 연구에 가장 적합한 것을 선택하기 전에 여러 유형의 벡터의 biodistribution을 비교해야 한다. 이것은 다른 serotype으로 패키징된 동일한 벡터 디자인 또는 동일한 serotype으로 패키징된 다른 벡터 디자인에서 발생할 수 있다. VectorBuilder는 동일한 동물 내에서 서로 다른 벡터의 biodistribution 을 평가하기 위한 플랫폼을 개발했다. 특히, 다른 바코드가 벡터에 추가되고, 주어진 조직에서 AAV 벡터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 분포는 바코드의 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 확인할 수 있다. 이 접근 방식은 비용과 시간을 크게 줄일 수 있으며, 더 중요하게는 조직 내의 다양한 벡터가 서로의 internal references로 사용될 수 있도록 하여 데이터의 민감도와 신뢰도를 높일 수 있다.
  • In house availability of many AAV serotypes: AAV 벡터를 패키징하기 위한 다양한 serotype을 제공한다 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, etc.). 또한 고객의 니즈에 따라 새로운 serotype을 신속하게 개발할 수 있다.
  • Multiple routes of administration: Tail vein injection, facial vein injection (for neonatal mice and rats), intracerebroventricular injection, intrathecal injection, subretinal injection, intravitreal injection, intratympanic injection, intramuscular injection등 다양한 AAV 투여 방법을 사용할 수 있다.
  • Full technical support: 경험이 풍부한 과학자들은 벡터 디자인 및 optimization에서 GMP 제조를 포함한 바이러스 패키징, 세포 배양 분석에서 동물 수술에 이르기까지 AAV 프로젝트의 모든 측면을 커버하는 포괄적인 기술 지원을 제공할 수 있다.

Experimental Data

다음은 고품질 AAV 생산 및 AAV biodistribution profiling에 대한 전문성을 보여주는 몇가지 예이다.

EGFP DAPI Merge
A Inner ear
B Hippocampus
Spinal cord anterior horn
C Retina
Liver
Pancreas
Skeletal muscle

Figure 1. AAV9 carrying CAG promoter driving EGFP was administered to mice by various routes. EGFP and DAPI fluorescence was analyzed in the following organs: (A) inner ear, images were taken 13 days after vector delivery by intratympanic injection to the left ear; (B) hippocampus and spinal cord anterior horn, images were taken 10 days after vector delivery by facial vein injection; (C) retina, liver, pancreas, and skeletal muscle, images were taken 12 days after vector delivery by tail vain injection.

 

EGFP DAPI Merge
Lung
Liver
Pancreas
Skeletal muscle

Figure 2. AAV1 carrying CMV promoter driving EGFP was administered to mice by tail vein injection. EGFP and DAPI fluorescence was analyzed in lung, liver, pancreas, and skeletal muscle. Images were taken 12 days after injection.

 

Figure 3. (A) AAV8 carrying ProA1 promoter driving mCherry or (B) AAV8 carrying hRHO promoter driving EGFP was administered to mice by subretinal injection. mCherry, EGFP, and DAPI fluorescence was analyzed in retina. Images were taken 20 days after injection.