EGFP 및 HiExpress™ Luciferase IVT mRNA

VectorBuilder는 in vitro 및 in vivo 실험을 위해 바로 사용 가능한 EGFP 및 luciferase mRNA를 제공합니다. VectorBuilder의 mRNA 품질 및 효능은 세포 배양 및 동물 모델 모두에서 높은 수준의 리포터 발현에 대해 완전히 검증되었으므로, mRNA 전달 및 발현의 효율성을 평가하는데 사용하거나 mRNA 실험을 위한 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 맞춤형 mRNA 생산 및 전달에 대해서는 VectorBuilder의 mRNA 유전자 전달 솔루션 을 확인하십시오.

중점 사항
  • Cap 1, 검증된 5' 및 3' UTR, 110 nt polyA tail로 생성된 mRNA, N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)과 같은 변형된 뉴클레오티드 포함 가능
  • 강력한 발현을 위해 코돈 최적화된 HiExpressTM Firefly Luciferase mRNA
  • 시퀀스 검증, 완전성, 캡핑 효율성, 순도 및 발현 검증을 포함한 포괄적인 품질 관리

주문 정보

가격 및 소요 시간

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배송 및 보관

mRNA 제품은 1 mM sodium citrate buffer (pH 6.4)에 저장하여 드라이아이스로 배송됩니다. mRNA는 -80°C 에서 최대 12개월 동안 보관할 수 있습니다. 반복적인 동결-해동은 피하십시오.

기술적인 정보

mRNA 생산 프로세스 및 QC

Figure 1. in vitro transcription에 의한 RNA 합성의 일반적인 워크 플로우.

VectorBuilder의 mRNA 생산 워크플로우는 선호하는 코돈, GC 함량 및 RNA 2차 구조의 열역학적 안정성을 고려하여 템플릿 DNA 서열의 디자인 및 합성한 후in vitro transcription 벡터에 클로닝합니다. 그런 다음 plasmid DNA를 정제, 검증 및 선형화한 후 in vitro transcription 반응을 거쳐 원하는 transcript를 생성합니다. 변형된 뉴클레오티드는 in vitro transcription중에 포함되어 in vivo translation을 개선하고 면역원성을 감소시킵니다. Co-transcriptional 또는효소 방식을 사용하여 고효율 캡핑(>95%)을 달성할 수 있습니다. 그런 다음 mRNA는 mRNA-capture beads에 의해 정제된 다음 추가 QC를 진행합니다.

실험에 의한 검증

Figure 2. HeLa 세포에서 EGFP IVT mRNA 발현. EGFP mRNA는 변형된 뉴클레오티드인 N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)을 있거나 없이 생성되었습니다. 12웰 플레이트에서 성장한 HeLa 세포를 웰당 1ug의 mRNA로 transfection 시켰습니다. (A) Transfection 24시간, 48시간 및 72시간 후 EGFP 발현은 flow cytometry에 의해 정량화되었습니다. Mean fluorescence intensities (MFI)는 컬러 막대로 표시하고 EGFP 양성 세포의 백분율은 원, 사각형 및 삼각형으로 표시하였습니다. 오차 막대는 표준 편차(SD)를 나타냅니다. (B) Transfection 후 48시간 후에 EGFP mRNA로 형질감염된 HeLa 세포의 사진.

Figure 3. in vitro 및 in vivo에서 HiExpressTM Firefly Luciferase IVT mRNA 발현. (A) HEK293T 세포에서 HiExpressTM Firefly Luciferase mRNA 및 기타 luciferase mRNA의 발현. 12-웰 플레이트에서 성장한 세포를 웰당 0.5ug의 mRNA로 transfection 시키고, transfection 후 6시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 luciferase 활성을 측정하였습니다. (B) 주사 후 6시간, 24시간 및 48시간에 30ug의 LNP encapsulated mRNA를 근육내 주사한 성체 C57BL/6 마우스에서 측정된 luciferase 활성. Fluc WT는 wild-type firefly luciferase를 나타냅니다. Fluc WT(co)는 codon-optimized wild-type firefly luciferase를 나타냅니다. Fluc2는 luc2 firefly luciferase를 나타냅니다.

문서 자료
물질안전보건자료 (MSDS) 시험 성적서 (COA) 사용 설명서 브로셔

자주 묻는 질문

mRNA cap과 capping 방법의 차이점은 무엇입니까?

Cap 0는 5’ to 5’ triphosphate linkage를 통해 진핵생물 mRNA의 5' 말단에 추가되는 N7-methylguanosine (m7G)을 나타냅니다. 이 변형은 co-transcription으로 발생하는 일련의 효소 반응을 통해 추가되고, nuclear export, 전사체 안정성을 조절하는 기능을 하고, eukaryotic translation initiation factor (eIF4E)에 의한 인식을 통해 mRNA의 translation을 촉진하는 기능을 합니다. Cap 1은 m7G cap 외에 전사된 mRNA 서열의 첫번째 뉴클레오타이드 (m7GpppNm)의 2'O에 메틸기가 추가된 것 입니다. 포유류 세포에서 cap 1 구조는 mRNA가 선천성 면역에 의해 표적화되지 않고 자가로 인식되는 중요한 마커이다. 합성된 mRNA에 cap 1 구조를 추가하면 in vivo에서 mRNA 발현이 향상되고 면역원성이 감소하는 것으로 입증되었습니다.

In vitro transcription된 RNA에 대한 capping은 cap analogs와 함께 co-transcription되거나 또는 효소 반응을 통해 transcription 후에 발생할 수 있습니다. Capping 방법의 효율성은 LC-MS를 사용하여 검증하고 있습니다.

mRNA에 변형된 뉴클레오타이드를 결합하는 것을 고려해야 하는 이유는 무엇이며, 어떤 것을 포함할 수 있습니까?

세포는 외부 RNA를 인식하면 면역 반응을 활성화하는 cytosolic 및 endosomal RNA receptors를 갖고 있습니다. 변형된 뉴클레오타이드는 일반적으로 endogenous cellular RNA에서 발견됩니다. mRNA에 특정 변형 뉴클레오티드를 포함하면 면역원성이 감소하고 2차 구조가 변경되며 서열 의존적 방식으로 translation 효율과 반감기가 증가합니다.VectorBuilder는 일반적으로 사용되는 N1-Methylpseudouridine(m1Ψ) 을 제공합니다. N1-Methylpsuedouridine tRNA에서 처음 확인된 자연 발생 뉴클레오타이드이지만, mRNA를 코딩하는데 사용하는 것을 최근에야 알게 되었습니다. Uridine의 이러한 메틸화된 유도체는 전통적인 Watson-Crick base pairing을 변경하지 않고 mRNA IVT 및 translation에서 표준 뉴클레오타이드를 대체할 수 있습니다. mRNA 치료제에 사용하는 주요 장점은 RNA immune receptors에 의한 인식을 변경하여 원치 않는 면역 효과를 완화하고 전사체 안정성 및 translation을 향상시키는 능력입니다.