유전자의 knockdown을 위해 몇 개의 shRNA를 테스트해야 할까요?

shRNA를 사용할 때 모든 shRNA가 작동하는 것은 아니라는 사실을 인지하는 것이 중요합니다. 다른 shRNA사이에 관찰되는 특이성과 효율성의 차이로 인해 종종 경험적으로 설계된 shRNA의 knockdown 효과가 제한됩니다. shRNA의 효능은 shRNA의 길이, 루프 구조, GC 프로파일과 열역학적 안정성, 타겟 서열의 2차 구조 및 다른 유전자에 대한 off-target 일치를 비롯한 여러 요인에 의해 결정됩니다. 일반적으로 shRNA의 ~50-70%는 눈에 띄는 knockdown 효과를 가지며, 그 중 ~20-30% 정도는 강한 knockdown을 보입니다. 그러므로 관심있는 유전자를 knockdown하기 위한 가장 강력한 shRNA를 찾기 위해 복수의 shRNA를 테스트하는 것이 중요합니다.

당사의 경험과 고객의 피드백을 바탕으로 임의의 유전자에 대해 3개 또는 4개의 shRNA를 테스트했을 때 일반적으로 2개 또는 3개는 적당하거나 우수한 knockdown을 생성한다는 것을 알고 있습니다. 특정 유전자를 표적으로 하는 몇 개의 shRNA로 시도했을 때 만족스러운 knockdown을 생산하지 못하는 경우도 있을 수 있습니다. 이런 경우 가장 좋은 접근 방법은 더 많은 shRNA, 특히 문헌 검증이 있는 shRNA를 시도하는 것입니다. 많은 연구자들은 또한 동일한 유전자를 표적으로 하는 shRNA 칵테일(다른 종류의 shRNA 혼합물)을 사용하는데 이는 때때로 knockdown 효율을 향상시킬 수 있습니다.

VectorBuilder는 일반적인 종에 최적화된 shRNA를 포함하는 shRNA 데이터베이스를 만들었습니다. 이 데이터베이스의 shRNA는 RNAi컨소시엄에서 사용하는 것과 같은 규칙을 적용하여 설계되고 점수가 매겨집니다. 당사의 온라인 디자인 툴을 이용하여 shRNA vector를 설계할 때 당사의 데이터베이스에서 타겟 유전자를 검색하는 옵션이 제공됩니다. 관심있는 유전자를 넣으면 UCSC Genome Brower에 대한 링크를 포함하여 우리가 설계한 shRNA의 상세한 정보를 볼 수 있습니다. 당사의 데이터베이스는 타겟 유전자에 대해 사용 가능한 shRNA에 대해 knockdown 점수가 감소하는 순서대로 순위를 매기고 가장 높은 knockdown 점수를 가진 상위 3개의 shRNA를 테스트하도록 권장합니다.

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렌티바이러스 벡터는 유전자발현을 장기간 knockdown하려는 응용분야에서 가장 선호되는 shRNA 전달 방법입니다. 그러나 여러 연구자들은 렌티바이러스 벡터 기반 방법의 기술적 복잡성과 더 높은 비용을 최소화하기 위해 타겟 유전자의 후보 shRNA를 transfection하고 검증하기 위한 방법으로 일반 plasmid 벡터 사용을 선호합니다. 최고의 knockdown 효율을 가진 shRNA가 확인되면 타겟 유전자의 안정적인 knockdown을 위해 렌티바이러스를 사용해 발현시킬 수 있습니다.

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