shRNA knockdown 스코어는 어떻게 계산되는가?

VectorBuilder는 the RNAi consortium (TRC)가 사용하는 것과 유사한 규칙을 적용하여 shRNA를 디자인하고 스코어를 매긴다. 각각의 주어진 RefSeq transcript에 대해 후보 타겟 사이트로 간주되는 가능한 모든 21mer를 검색한다. 후보들 중 run of ≥4 of the same base, a run of ≥7 G or C, GC content <25% or >60% 및 AA at the 5’ end포함하여 knockdown efficiency/ specificity 또는 cloneability을 감소시키는 것으로 생각되는 특징을 포함하고 있는 경우는 제외된다. internal stem-loop, high GC content toward the 3’ end, known miRNA seed sequences 또는 off-target matches to other genes을 포함하는 후보는 knockdown 스코어에 감점을 준다. 대체 가능한 transcripts을 갖는 유전자의 경우 모든 transcripts에 존재하는 타겟 사이트에 더 높은 점수를 부여한다.

모든 점수는 0 이상이며 평균은 ~5, 표준 편차는 ~5, 95%는 15 이하이다. Knockdown 스코어가 약 15인 shRNA는 knockdown 성능과 cloneability가 가장 뛰어난 것으로 평가되는 반면, knockdown 스코어가 0인 shRNA는 knockdown 성능이 가장 나쁘거나 클로닝하기 어렵다.

Knockdown 스코어는 대략적인 가이드에 불과하다는 점에 유의하세요. 실제 knockdown efficiency는 스코어가 예측하는 것과 크게 다를 수 있다. 타겟 사이트의 스코어가 낮아도 잘 작동할 수 있다. 또한 3' UTR을 타겟으로 하는 것이 코딩 영역을 타겟팅하는 것만큼 효과적일 수 있다는 점에 유의하세요.