MegaAAV™ Delivery System

Figure 3. MegaAAV™ split 벡터 시스템을 사용한 in vitro에서 DMD의 성공적인 재구성 (reconstitution). Human DMD 유전자 (~11 kb)를 세 부분 (DMD-I, DMD-II, DMD-III)으로 분할하여, 각각 별도의 AAV 벡터에 패키징하였습니다. HEK293T 세포에 세 부분 모두를 포함하는 MegaAAV™ 또는 각 부분만을 포함하는 MegaAAV™를 transduction 시켰습니다 (MOI = 10⁵ per AAV). Transduction 48시간 후 세포 용해물 (cell lysates)을 수확하였습니다. Transduction되지 않은 세포 (NC)와 전체 길이 (full-length) DMD를 코딩하는 plasmid를 transduction시킨 세포를 양성 대조군 (PC)으로 사용하였습니다. 모든 샘플은 DMD-II 및 DMD-III 내 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 Western blot 분석을 수행하였습니다. 분홍색 화살표는 DMD 유전자의 완전한 in vitro 재구성을 나타내고, 청록색 화살표는 DMD 단편을 나타냅니다.

Figure 4. MegaAAV™ 유전자 전달을 통한 효과적인 표현형 복원 (phenotype restoration). 인간 망막 유전자 (약 6 kb)를 두 부분, 즉 N-말단 FLAG tag를 포함하는 5' GOI와 C-말단 HA tag를 포함하는 3' GOI로 분할한 뒤, 각각 별도의 AAV8 기반 컨스트럭트에 패키징 하였습니다. (A) 두 컨스트럭트를 모두 포함하는 MegaAAV™ 또는 개별 컨스트럭트 (MOI = 10⁵)를 HEK293T 세포에 transduction하였고, transduction 72시간 후 cell lysate를 수집하였습니다. Transduction 하지 않은 세포 (NC)와 C-말단 HA tag가 있는 전장 (full-length) 유전자를 암호화하는 plasmid로 transfection한 세포 (PC)를 대조군으로 포함하였습니다. 분홍색 화살표는 망막 유전자의 완전한 in vitro 재구성을 나타내는 반면, 청록색 화살표는 분할된 유전자 단편을 나타냅니다. (B-C) 2주령의 형질전환 knockout 마우스에 epitope tags가 없는 동일한 5' 및 3' 부분의 유전자를 암호화하는 MegaAAV™를 투여하였습니다. 주사 후 3주 차에 측정한 망막전위도 (electroretinograms)의 (B) b-wave (별표) 및 (C) 원뿔세포 (cone) 발현 분석에서 나타난 바와 같이, 투여군 마우스에서 시각 기능과 망막 형태가 모두 크게 회복되었습니다. WT 및 약물을 투여하지 않은 knockout (KO) 마우스도 대조군으로 포함되었습니다.