DMD를 치료하는 GLAd

화물 크기가 핵심

Duchenne 근이영양증(DMD)은 5,000명당 ~1명에게 영향을 미치는 유전질환입니다. 이 질병은 근쇠약과 손실을 초래하고 결국 디스트로핀(Dystrophin) 유전자의 유전적 돌연변이로 인해 사망에 이르게 됩니다. 디스트로핀은 인간 게놈에서 알려진 가장 큰 유전자이며 DNA의 2.4Mb에 걸쳐 있으며 RNA polymerase에 의해 전사되는 데 ~16시간이 걸립니다. 이 유전자가 크기 때문에 AAV나 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터 시스템으로는 치료를 위해 전체 유전자를 전달할 수 없습니다.

Figure 1. β-actin유전자 크기(37Kb)와 비교한 DMD 유전자 크기(2.4Mb)의 규모를 표현함.

AAV 벡터를 사용하여 DMD를 치료하는 다른 접근 방식이 탐색되었지만 이러한 구조는 벡터 유전자 운반 크기의 제약으로 인해 디스트로핀 유전자의 미니어처 버전을 제공합니다. AAV의 운반 능력은 4.7kb 길이의 유전자로 제한됩니다. DMD에 대한 마이크로 디스트로핀을 발현하는 AAV 유전자 치료는 다양한 임상 시험 단계에 있으며 현재 결과를 평가하고 있습니다. AAV 시스템이 유전자 치료에 널리 사용되고 있고 임상 시험에서 면역 반응과 부작용이 최소화되었지만 전체 길이의 디스트로핀 유전자를 대체할 수 있는 이 시스템은 임상 연구 가치가 있습니다.

CRISPR 유전자 편집은 또한 DMD의 잠재적 치료법으로 조사되고 있습니다. 이 접근법에서 돌연변이는 수정 대상이 될 수 있습니다. 이 접근법은 전임상 모델에서 연구되었습니다. 그러나 DMD는 다양한 돌연변이에서 발생할 수 있으므로 이 치료 접근법은 다양한 유전적 돌연변이에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한 DMD를 유발하는 특정 돌연변이는 현재 CRISPR/Cas9 기술로 구제할 수 없습니다.

Gutless adenovirus

아데노바이러스는 이식유전자의 발현이 일시적이고 에피솜에서 일어나는 특성과 상대적으로 큰 유전자 운반 능력으로 인해 널리 사용되는 유전자 전달 시스템입니다. 아데노바이러스의 인기있는 serotype에는 인간 Ad5 및 키메라 Ad5/F35가 포함됩니다. 인간 Ad5는 콕사키 및 아데노바이러스 수용체(CAR)를 통해 세포에 결합하고 세포에 들어가지만, 높은 수준의 CAR을 발현하지 않는 치료 및 실험 시스템에서는 키메라 Ad5/F35 serotype을 사용하여 이 문제를 피할 수 있습니다. 키메라 Ad5/F35 serotype은 광범위하게 발현되는 막 관통 수용체인 CD45에 결합하는 F35 serotype의 일부를 포함합니다.

Gutless adenovirus(GLAd)는 위에서 언급한 균주에 대한 대안으로 기존의 재조합 아데노바이러스 균주와 다른 방법을 통해 생산됩니다. gutless 방법에서, 선형화된 플라스미드는 Cre recombinase를 발현하는 세포에 플록스 패키징 신호를 포함하는 헬퍼 바이러스와 함께 트랜스펙션됩니다. 이어서 헬퍼 바이러스는 Cre 재조합을 통해 불활성화되고, 미정제 바이러스는 세포로부터 추출된 후 추가 증폭됩니다.이러한 생산 방법으로 인해 gutless adenovirus는 패키징 및 복제에 필요한 것을 제외한 거의 모든 바이러스 서열이 결핍되어 큰 목적유전자를 삽입할 수 있습니다. 다른 시스템과 달리 GLAd는 성숙한 Dystropin mRNA(14.0kb)를 두 번이나 발현시킬 수 있는 충분한 화물 용량을 가지고 있습니다.

Figure 2. Production workflow of gutless adenovirus at VectorBuilder.

GLAd의 사용은 현재 헌팅턴병과 DMD를 포함한 광범위한 유전질환을 치료하기 위해 연구되고 있습니다. 유전자 치료에 GLAd를 사용하는 것은 현재 사용 중인 다른 시스템에 비해 화물 크기가 매우 크기 때문에 특히 매력적입니다. 현재 일반적으로 사용되는 AAV 시스템은 4,4kb 유전자를 탑재할 수 있는 반면 VectorBuilder에서 생산되는 GLAd는 33kb의 유전자를 수용할 수 있습니다.

사실, McGill대학의 연구원들은 마우스 디스트로핀 유전자의 두 복사본을 발현하는 접근 방식을 시도했고 근이영양증 마우스 모델에서 주요 치료 이점을 관찰했습니다. 디스트로핀 유전자의 발현은 결국 손실되었지만, 이 시스템을 더욱 최적화하면 DMD에 대한 잠재적인 삶을 변화시키는 치료제로 이어질 수 있습니다.¹

Conclusion

Duchenne 근이영양증은 점진적인 근육 약화를 초래하는 쇠약한 유전 질환이며 결국 환자는 질병에 굴복하게 됩니다. 현재 DMD에 대한 치료법이 없기 때문에, 그 질병에 대한 잠재적인 유전치료법에 대한 추가 연구가 시급합니다. GLAd는 면역 부작용이 거의 없고 형질전환 유전자의 장기 발현을 가능하게 하는 최근 개발된 기술입니다. 아데노바이러스는 이전에 DMD의 마우스 모델에서 대체 디스트로핀을 전달하는 데 사용되었으며 유전자 치료를 위한 아데노바이러스의 임상 적용이 나타나기 시작했습니다.

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Sources

1. Dudley RW, Lu Y, Gilbert R, Matecki S, Nalbantoglu J, Petrof BJ, Karpati G. Sustained improvement of muscle function one year after full-length dystrophin gene transfer into mdx mice by a gutted helper-dependent adenoviral vector. Hum Gene Ther. 2004 Feb;15(2):145-56. doi: 10.1089/104303404772679959. PMID: 14975187.

2. Ricobaraza A, Gonzalez-Aparicio M, Mora-Jimenez L, Lumbreras S, Hernandez-Alcoceba R. High-Capacity Adenoviral Vectors: Expanding the Scope of Gene Therapy. Int J Mol Sci. 2020 May 21;21(10):3643. doi: 10.3390/ijms21103643. PMID: 32455640; PMCID: PMC7279171.

3. Palmer D, Ng P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 2003 Nov;8(5):846-52. doi: 10.1016/j.ymthe.2003.08.014. PMID: 14599819.

4. Elangkovan N, Dickson G. Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. J Neuromuscul Dis. 2021;8(s2):S303-S316. doi: 10.3233/JND-210678. PMID: 34511510; PMCID: PMC8673537.