나 먼저! 다중 유전자가 있는 벡터를 최적화하려면 어떻게 해야 할까요?

유전자 전달 시스템은 하나의 유전자 뿐만 아니라 여러 구성요소인 promoter, open reading frame (ORF), 그리고 marker를 효율적으로 도입할 수 있게 해줍니다. 이런 시스템은 여러 ORF, 여러 융합된 또는 연결된 리포터, 심지어 전체 발현 카세트를 포함하는 벡터를 생성하여 개별 실험의 요구사항에 맞게 맞춤화할 수 있습니다. 이러한 벡터의 효율적인 전달은 특히 렌티바이러스 벡터를 사용할 때 여러 사항을 신중하게 고려해야 합니다. VectorBuilder는 여러 ORF를 포함한 벡터의 설계 및 최적화와 관련된 주요 요소들을 안내해 드립니다.

다른 유전자, 다른 운전자

여러 유전자를 도입하는 한 가지 옵션은 별도의 발현 카세트를 삽입하는 것입니다. 특히 운반 능력이 큰 piggyBac과 같은 다른 프로모터나 시스템을 활용하는 경우 더욱 유용합니다. 이 경우 별도의 전사 이벤트를 보장하기 위해 관심 있는 각 유전자에 대해 개별 프로모터, ORF 및 polyA tail가 삽입됩니다. 이는 (1) TRE 프로모터에 의해 구동되는 관심 유전자 및 (2) 하나 이상의 프로모터에 의해 구동되는 Tet 조절 단백질을 포함하는 all-in-one inducible gene expression vectors를 설계할 때 흔히 볼 수 있습니다.

중요한 것은 여러 발현 카세트를 설계하는 것은 대부분의 벡터 시스템에서는 가능하지만 렌티바이러스에는 적합하지 않습니다. 렌티바이러스의 긴 말단 반복서열(LTR)는 게놈 통합을 촉진하고 재조합 바이러스 게놈의 전사 시작과 종료를 표시합니다. 3' LTR은 polyadenylation 신호로 작용하기때문에 렌티바이러스 벡터의 내부 polyA를 포함하면 전사가 조기에 종료됩니다. 따라서 3' LTR은 전사되지 않아 바이러스 역가가 감소합니다.

재시작 또는 건너뛰기

렌티바이러스 및 일반적으로 벡터 시스템의 경우, 여러 ORF를 도입하는 인기 있는 방법은 폴리시스트론 또는 멀티시스트론을 만드는 것입니다. 여기서 여러 유전자는 하나의 프로모터 하류에 링커(linker)와 함께 배치됩니다. 모든 ORF는 하나의 mRNA 가닥으로 함께 전사되며, 링커는 개별 단백질의 번역을 촉진합니다. 가장 일반적으로 사용되는 링커는 IRES와 2A 펩타이드(P2A, T2A, E2A, F2A)입니다. 이 두 클래스는 아래 표에서 비교됩니다.

섞어보기

선택한 ORF를 어떻게 분리할지 결정한 후, 추가적인 고려 사항은 특히 ORF의 배치 순서에서 최적화를 도울 수 있습니다. 다중 시스트론 발현을 최적화할 때, 상대적인 위치가 발현 프로필에 미치는 영향에 대한 흥미롭고 거의 연구되지 않은 질문이 있습니다.

여러 형광 단백질을 사용한 이전 연구에서는 각 유전자의 발현 수준이 폴리시스트론 전사체 내 위치에 따라 달라진다는 것을 보여주었습니다. 보다 생리학적으로 관련된 상황에서 다양한 배열이 발현 프로필에 미치는 영향을 조사하기 위해, 우리는 세 가지 인간 내인성 유전자의 발현을 비교했습니다. 이들은 세 유전자의 모든 배열을 포함하는 6개의 폴리시스트론 렌티바이러스 벡터에서 발현되었습니다. P2A와 T2A는 각각 첫 번째와 두 번째 링커로 사용되었습니다(Fig. 1A).

서로 다른 위치에서 특정 유전자의 발현 수준을 비교했을 때(Fig. 1B 및 1C), 일반적으로 ORF가 프로모터에 가장 가까이 배치되었을 때 발현 수준이 가장 높게 나타났습니다. ORF가 세 번째 위치에 배치되었을 때는 발현 수준이 일관되게 가장 낮았으며, 첫 번째 위치에 비해 최소 80% 감소했습니다.

흥미롭게도, 특정 유전자의 상대적 발현 수준은 자체 위치뿐만 아니라 다른 두 유전자의 순서에 의해서도 영향을 받을 수 있습니다(Fig. 1B). 예를 들어, Gene B의 발현 수준은 첫 번째 위치에 배치되었을 때(Vectors 3 및 4) 가장 높았지만, Gene C가 두 번째 위치에 있을 때 Gene A에 비해 5배 증가했습니다(Vector 3과 Vector 4 비교). 두 벡터 모두에서 두 번째 유전자의 발현 수준도 크게 영향을 받았습니다.

특정 ORF의 발현은 구조의 끝으로 이동할수록 급격히 감소할 수 있지만, 폴리시스트론 구조 내 다른 ORF의 배열에 의해 발현이 영향을 받을 수도 있습니다. 선택한 유전자의 위치를 최적화함으로써 실험별 발현 목표를 달성할 수 있습니다.

Figure 1. 2A 링커로 연결된 폴리시스트론 벡터의 위치에 따른 유전자 발현 수준 비교. (A) P2A 및 T2A 펩타이드가 삽입된 3개의 ORF를 포함하는 트리시스트론 렌티바이러스 벡터를 렌티바이러스에 포장했습니다. 그런 다음 포유류 세포를 형질도입하고, flow cytometry를 통해 3개 ORF의 여섯 가지 배열에서 각각의 유전자 발현을 평가했습니다. (B) 여섯 가지 배열에는 A-B-C, A-C-B, B-C-A, B-A-C, C-B-A 및 C-A-B가 포함되었습니다. 보다 직접적인 비교를 위해, 우리는 A-B-C 순서의 발현 수준을 기준으로 주어진 배열 내에서 각 유전자의 발현 수준을 정규화했습니다. (C) 트리시스트론 벡터 내의 특정 위치에서의 단백질 발현 수준을 비교했습니다. 우리는 서로 다른 위치에 있는 각 유전자의 발현 수준을 첫 번째 위치의 발현 수준으로 정규화(normalize)했습니다.

결론

다양한 유전자는 세포 유형, 벡터 전달 시스템, 필요한 프로모터의 수, 각 유전자의 특정 발현 요구 사항에 따라 다양한 방법으로 표적 세포에서 발현될 수 있습니다. 렌티바이러스 벡터를 사용할 때에는 별도의 발현 카세트를 단일 벡터에서 사용할 수 없기 때문에 주목할 만한 제한 사항이 있습니다. 그러나 링커를 신중하게 고려하고 관심 유전자의 순서를 검토함으로써 발현 수준을 실험에 최적화할 수 있습니다. VectorBuilder의 기술 지원 팀은 클로닝 및 복잡한 벡터 패키징 분야에서 수십 년간의 축적된 경험을 활용하여 이러한 최적화를 도와드립니다.

Source

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