Snip Snap: 트랜스포존의 시간

유전자 전달 실험을 설계할 때 가장 먼저 해결해야 할 질문 중 하나는 바이러스 전달을 사용할 것인가, 비바이러스 전달을 사용할 것 인가입니다. 많은 수의 바이러스 벡터 옵션이 있지만, 비바이러스 전달 옵션을 과소평가하기 쉽습니다. 연구자들이 물어야 할 두 번째 질문은 '장기 유전자 발현이 필요한가', '단기 유전자 발현이 필요한가' 입니다. 트랜스포존(transposon)과 트랜스포제(transposase)를 운반하는 플라스미드를 사용한 비바이러스 벡터로 장기 발현은 달성할 수 있습니다. 하지만 어떤 시스템을 사용해야 할까요? 어떻게 사용해야 할까요? 어떻게 최적화할 수 있을까요? VectorBuilder가 여러분의 모든 불타는 점프 유전자기 질문에 대한 답을 제공합니다.

트랜스포존(Transposons): 여기저기 뛰어다녀 (Jump! Jump!)

1960년대 DNA가 어떻게 전사되고 번역되어 단백질로 만들어지는지 밝혀지기 전에도 식물의 염색체에서 유전 요소가 이동하는 것이 관찰되었습니다. 이러한 전이 요소(트랜스포존, transposon)는 나중에 바이러스에서부터 포유류까지 모든 것에서 발견되었습니다. 수십 년 내에 분자생물학 분야의 폭발적인 발전은 트랜스포존을 연구할 뿐만 아니라 편집하고 숙주 세포 게놈에 유전 물질을 도입하는 데 사용할 수 있게 되었습니다.

자연에서 DNA 트랜스포존은 트랜스포제의 코딩 영역을 둘러싸는 말단 반복(terminal repeats, TR)으로 존재합니다. 이 트랜스포제 효소는 TR 및 게놈 부위에서 이중 가닥 절단을 도입하여 전체 트랜스포존 영역을 전위(translocation)시킵니다. 트랜스포제의 지속적인 발현은 지속적인 전좌(translocation)를 촉진합니다. 이 시스템은 트랜스포제로부터 트랜스포존을 분리하고, 삽입할 유전 물질을 TR 사이에 배치함으로써 유전자 전달에 쉽게 적용될 수 있습니다(Fig 1).

Figure 1. 자연에서 트랜스포존은 유전자 전달을 위해 플라스미드의 구성 요소로 분리될 수 있습니다.

DNA 트랜스포존은 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터에 비해 중요한 장점을 가지고 있습니다: 생산 비용이 훨씬 낮고 바이러스 벡터보다 기술적으로 간단하며, 면역 반응의 위험이 낮습니다. 그러나 플라스미드를 사용하는 것도 상당한 단점이 있습니다. 주로 많은 세포 유형을 형질 전환하기 어려우며, 생체 내 형질 전환에 한계가 있다는 것입니다.

플라스미드 선택

게놈 통합을 갖춘 비바이러스 벡터 시스템을 결정한 후 piggyBac, Sleeping Beauty 및 Tol2 중에서 선택할 수 있는 여러 시스템이 있습니다. 각각은 표준 구성 요소를 활용합니다.

1. 말단 반복부(Terminal repeats, TR)가 측면에 있는 GOI(프로모터, polyA tail 등을 포함한 관련 구성 요소 포함)를 포함하는 "트랜스포존 플라스미드"..

2. 상응하는 트랜스포사제(transposase)효소. 이는 "헬퍼 플라스미드" 또는 mRNA로 전달될 수 있거나 트랜스포사제를 안정적으로 발현하는 세포/동물 계통이 사용될 수 있습니다.

참고: 효율적인 게놈 통합을 위해서는 일치하는 트랜스포제와 트랜스포존만 사용할 수 있습니다. 즉, PiggyBac 트랜스포사제(PBase)는 Sleeping Beauty 또는 Tol2 트랜스포존과 함께 효과적으로 사용할 수 없습니다.

PiggyBac

가장 널리 사용되는 트랜스포존 시스템 중 하나는 유전자, shRNA, 재조합 항체 등을 도입하는 데 사용할 수 있는 piggyBac 벡터 시스템입니다. 이 시스템은 CRISPR/Cas9 게놈 편집과 같은 다른 접근 방식과 결합될 수도 있습니다. piggyBac 트랜스포존 벡터의 큰 운반 능력은 5'와 3' TR 사이에 최대 27kb의 DNA를 운반할 수 있기 때문에 인기를 얻습니다. piggyBac 트랜스포사제는 삽입을 위해 TTAA 부위의 염색체 DNA를 절단하며 유전자 내 영역을 선호합니다.

초기 발견 이후, piggyBac 트랜스포존과 트랜스포제를 모두 효율성을 높이기 위해 수정해 왔습니다: 트랜스포존은 절단되었고, 트랜스포제는 코돈 최적화와 돌연변이 유도 과정을 거쳐 초활성화되었습니다. 원래의 트랜스포제인 PBase는 Sleeping Beauty나 Tol2 트랜스포제보다 높은 효율을 가지지만, 수정된 버전인 hyPBase는 최대 15배 높은 전이 효율을 달성할 수 있습니다. 또한, 추가로 수정된 hyPBase는 절단 능력을 가지면서도 통합 능력이 없으므로, 통합된 삽입물이 재삽입 없이 제거되어 흔적을 남기지 않습니다. 참고로, hyPBase는 현재 관련 특허가 있으므로 상업용 벡터 개발 시 적절한 자문을 통해서만 사용해야 합니다.

Sleeping Beauty

Sleeping Beauty(SB) 벡터 시스템은 특히 CAR T 세포 치료와 같은 임상 환경에서 무작위 통합 경향과 TA 이핵산(dinucleotide) 절단 부위 의존성으로 인해 인기가 있습니다. piggyBac 시스템과 유사하게, SB는 효율적인 트랜스포제를 가지고 있으며 이는 초활성화 변형체(SB100X)로 수정되었습니다. 그러나 SB100X는 대부분의 세포 유형에서 hyPBase보다 효율이 낮습니다. 또한, SB는 약 8 kb의 낮은 화물 용량을 가지고 있으며 절단 후 CAG 흔적을 남깁니다.

세 가지 통합 벡터 시스템 모두 제한된 표적 세포 유형 범위라는 중요한 제한을 가지고 있지만, Sleeping Beauty는 HSV 및 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 시스템과 결합하여 세포 표적화를 향상시키면서 통합 기능을 유지합니다.

Tol2

서열 편향이 없고 더 유연한 유전체 영역에 통합되는 경향이 있어, Tol2는 동물 계통 수립에 널리 사용되는 시스템입니다. 시스템의 운반 용량은 11 kb로 중간 수준이며, 트랜스포제 활성도 높지만 piggyBac 또는 SB 트랜스포제보다 낮은 경향이 있습니다. 특히 Tol2는 어류 모델에서 높은 활성을 보이며, 제브라피쉬 계통을 만드는 데 전통적으로 사용됩니다.

아래 표는 piggyBac, Sleeping Beauty, Tol2 벡터 시스템 간의 주요 비교 내용을 제공합니다.

트랜스포존 문제

전이 효율이 낮을 경우, 문제는 트랜스포존 벡터, 트랜스포제 또는 둘 다에 있을 수 있습니다. 가장 첫 번째이자 쉬운 확인 단계는 트랜스포존과 트랜스포제의 비율을 점검하는 것입니다. PBase를 사용하는 piggyBac 시스템의 경우, 1:1 비율로 시작할 것을 권장하며, 자세한 내용은 여기를 참조하십시오. 트랜스포제 농도를 증가시키면 통합 효율이 높아질 수 있지만, 이는 높은 유전 독성 효과를 초래할 수 있습니다. 대신 트랜스포존 벡터의 농도를 증가시키는 것이 효율성을 더 향상시킬 가능성이 높습니다.

트랜스포제를 도입하는 방식도 통합 효율성과 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 가장 인기 있는 두 가지 옵션은 트랜스포제 플라스미드와 mRNA입니다. 플라스미드는 효율성이 더 높을 수 있지만, 장기적인 트랜스포제 발현 및 활성이 지속될 위험과 트랜스포제의 게놈 통합 위험이 낮습니다. 두 경우 모두 트랜스포제의 지속적인 활동은 트랜스포존의 절단 및 재통합을 초래할 수 있으며, 이는 잠재적인 숙주 유전자 파괴를 초래할 수 있습니다. 트랜스포제 mRNA를 이용하면 효율성은 낮아지지만, 트랜스포제 통합 위험 없이 단기 발현을 보장합니다.

결론

비바이러스 벡터는 유전자 기능 연구 및 세포 치료 전달을 포함한 유전자 전달 분야에서 중요한 점점 개선되는 접근 방식을 나타냅니다. 트랜스포존과 트랜스포제의 다양한 옵션에서의 최적화는 계속 진행되고 있으므로 연구자들은 자신의 연구에 최적의 접근 방식을 활용할 수 있다는 확신을 가질 수 있습니다. 벡터 시스템, 트랜스포제 또는 삽입물을 선택하는데 있어 VectorBuilder가 서포트해 드릴 수 있습니다.

Source

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