다양한 promoter, 부족한 시간: 효과적인 유전자 전달을 위한 범용 promoter 선택
Keywords: Promoter, cloning, CMV, CAG, lentivirus, AAV
유전자 전달 벡터를 설계할 때 프로모터 선택은 중요한 고려 사항 중 하나입니다. 주어진 벡터에 이상적인 프로모터는 원하는 수준과 표적 조직 또는 세포에서 관심 유전자(GOI)가 발현되도록 보장합니다 (Figure 1). 연구 목표에 따라, 구성적, 조직 특이적, 범용, 유도성, 바이러스성 또는 비바이러스성 프로모터를 고려할 수 있습니다. 연구자들은 실험에서 다양한 세포 유형 간 일관된 유전자 발현을 보장하기 위해 범용 프로모터를 선택합니다. 이 글에서는 일반적으로 사용되는 범용 프로모터의 개요와 성공적인 유전자 전달을 위해 벡터 설계에 이를 통합하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.
Figure 1. 프로모터 및 기타 벡터 구성 요소의 도식적 표현
일반적인 고려사항
유전자 발현을 위한 범용 프로모터를 선택할 때는 프로모터 강도, 길이, 그리고 GOI의 원하는 발현 수준 등 세 가지 주요 요소 간의 균형을 맞추는 것이 중요합니다. 프로모터 강도는 일반적으로 생물학적 질문, 조직 또는 세포 유형, 그리고 원하는 발현 수준에 따라 결정됩니다. 강력한 프로모터인 CMV, CAG, CBh, EF1α는 높은 수준의 전사를 촉진하여 강력한 단백질 생산이 필요할 때 사용됩니다. 반면, 더 낮고 생리학적으로 적절한 발현 수준이 필요할 때는 PGK, SV40, MSCV 또는 EFS와 같은 중간 강도의 프로모터가 선호됩니다. 이는 다양한 세포 유형에 걸쳐 안정적이고 중간 정도의 발현을 제공하기 때문입니다.
프로모터의 길이는 또 다른 중요한 고려 사항으로, 벡터의 운반 용량에 의해 자주 영향을 받습니다. 만약 GOI가 길고 벡터의 운반 용량이 제한적이라면, 더 짧은(대개는 더 약한) 프로모터가 사용됩니다. 반대로 GOI가 짧다면 더 길고 강한 프로모터가 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 약 4.7 kb의 제한된 운반 용량을 가진 AAV 시스템에서는, GOI가 길 경우 공간 조정을 위해 중간 강도의 EFS 프로모터(232 bp)가 권장됩니다. 따라서 특정 발현 시스템에 적합한 프로모터를 선택하는 것은 벡터의 화물 용량, GOI의 길이 및 원하는 발현 수준 간의 섬세한 균형입니다.
가장 인기 있는 범용 프로모터 중 일부는 바이러스 및 비바이러스 출처에서 유래됩니다. CMV는 작은 크기(589 bp)와 다양한 세포 유형에서 강력한 발현을 유도할 수 있는 능력 덕분에 가장 널리 사용되는 범용 바이러스 프로모터 중 하나입니다. CMV 프로모터는 특히 in vitro 연구에서 강력한 유전자 발현에 매우 효과적이지만, 줄기 세포와 같은 특정 세포 유형에서는 시간이 지남에 따라 침묵 될 가능성이 있음을 주의해야 합니다. EF1α와 같이 널리 발현되는 유전자에서 유래한 비바이러스 프로모터 특히 장기 발현 및 in vivo 응용에 있어 더 안정적이고 생리학적으로 관련 있는 발현 수준을 제공합니다. 또한, EF1α는 CMV보다 침묵 될 가능성이 낮아, 프로모터 침묵을 피해야 하거나 CMV silencing이 예상될 때 더 적합합니다. 프로모터의 강도, 길이 및 시퀀스를 포함한 프로모터에 대한 더 많은 정보는 VectorBuilder의 벡터 구성요소 가이드에서 확인할 수 있습니다.
프로모터 선택은 특정 시스템, 응용 분야 및 실험 매개 변수에 따라 달라지므로, 올바른 범용 프로모터를 선택하기 위한 VectorBuilder의 다년간의 유전자 전달 경험에서 요약된 몇 가지 설계 팁을 소개합니다.
(1) 바이러스 유전자 전달 시스템을 위한 프로모터 선택: 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터를 사용할 때, 프로모터 선택은 GOI 발현과 바이러스 패키징의 성공을 보장하기 위해 매우 중요합니다. AAV 벡터의 경우, CMV 프로모터는 다양한 세포 유형에서 강력하고 구성적인 발현 때문에 in vitro에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나, in vivo에서 전달된 AAV에서 CMV 프로모터의 넓은 침묵 현상이 관찰되어, CMV 프로모터가 숙주 시스템에 의해 바이러스 요소로 인식될 수 있음을 나타냅니다. 결과적으로, in vivo 사용을 위해서는 AAV에서 광범위한 발현을 위해 CAG(1733 bp), CBh(798 bp), EF1α(1178 bp)와 같은 다른 강한 프로모터가 선호됩니다.
렌티바이러스 벡터에서는 CAG 프로모터가 주요한 제한 사항을 가지고 있으며, 이는 높은 GC 함량으로 인해 바이러스 패키징 중 낮은 바이러스 역가로 이어질 수 있습니다. 따라서 렌티바이러스 벡터에서는 CAG 프로모터 대신 CMV 및 EF1α 프로모터가 권장됩니다. 렌티바이러스 벡터 설계에서 또 하나 중요한 고려 사항은 여러 발현 카세트에 동일한 프로모터를 사용하는 것을 피하는 것입니다. 동일한 두 프로모터는 렌티바이러스에서 상동 재조합이 발생할 가능성이 높아, 그 사이에 위치한 유전자가 삭제될 수 있습니다. 따라서 여러 유전자의 발현을 유도하기 위해 다른 프로모터를 사용하는 것이 권장되며, 또는 IRES나 2A와 같은 linker를 사용하여 폴리시스트론에서 여러 유전자를 발현시켜 재조합 위험을 줄이는 것이 좋습니다.
(2) 발현 대상(GOI vs 마커)을 위한 프로모터 선택: 형질전환 유전자 및 선택 마커가 모두 포함된 벡터를 설계할 때, 각 ORF에 적합한 프로모터를 선택하는 것이 매우 중요합니다. GOI의 경우 높은 수준의 발현이 필요한 경우가 많으므로 CMV나 CBh와 같은 강력한 프로모터가 일반적으로 사용됩니다. 형질전환 유전자 발현은 enhancers, silencers, 및 기타 조절 요소가 필요 할 수 있으며 이는 벡터의 화물 용량에 맞아야 하므로 더 작은 프로모터가 이상적입니다. 선택 마커는 주로 양성 형질전환/형질도입된 세포를 식별하거나 선택하는 데 사용되므로, 보통 중간 수준의 발현이면 충분합니다. 마커는 모든 표적 세포 유형에서 발현되어야 하며 더 큰 구조의 일부이므로 공간을 절약하기 위해 작은 프로모터가 선호됩니다. 발현 시스템에 따라 더 작고 중간 강도의 범용 프로모터가 마커에 이상적이며, 이는 다양한 세포 유형에 걸쳐 안정적이고 중간 수준의 발현을 제공합니다.
(3) 독성 유전자를 발현할 때 프로모터 선택: 유전자 발현을 유도하기 위해 강한 프로모터를 사용하는 것이 항상 유익하지는 않다는 점을 유의해야 합니다. 이는 세포 독성이나 다른 부정적인 생리학적 결과를 초래할 수 있습니다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에서 Gag와 Pol 유전자는 바이러스 입자 생산에 필수적이지만, Gag가 높은 수준으로 발현될 경우 과도한 입자 형성을 초래하여 세포 자원이 고갈될 수 있으며, Pol의 과발현은 DNA 복제 및 수리를 방해하여 게놈 불안정을 초래할 수 있습니다. Myc와 같은 종양 유전자의 과발현은 제어되지 않는 세포 증식을 유도하고 세포 스트레스 경로를 유발하여 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 따라서 독성 유전자를 클로닝할 때는 더 약한 프로모터가 선호됩니다. 예를 들어, 마우스 Foxn1(증식 조절 유전자)을 유도하는 중간 강도의 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터가 강력한 프로모터를 사용하는 동일한 벡터에 비해 10배 더 높은 역가를 생성한다는 것을 발견했습니다.확인되었습니다.
(4) 소형 non-coding RNA를 위한 프로모터 선택: U6 및 H1과 같은 Pol III 프로모터는 벡터 기반 유전자 녹다운/녹아웃 시스템에서 guide RNAs(gRNA) 또는 shRNA를 생성하는 데 일반적으로 사용됩니다. Pol III는 짧고 mRNA 안정성, 핵 내 수출 및 번역에 필요한 5' cap과 3' poly A tail이 없는 소형 non-coding RNA를 전사하는 데 특화되어 있으며, Pol III는 소형 non-coding RNA에 적합한 프로모터지만, 단백질 코딩 유전자의 발현에는 적합하지 않습니다.
| Not recommended | Why it is not recommended |
|---|---|
| Using CMV promoter in AAV vectors intended for ubiquitous expression in vivo | Frequent silencing in host cells in vivo |
| Using CAG promoter in lentiviral vectors | Significantly reduced packaging efficiency and viral titer |
| Using same promoter to drive two genes in lentiviral vectors | Frequent recombination between promoters leading to deletion of sequence between promoters |
| Pol II promoter used to drive small non-coding RNA expression | Failure of transcription |
| Un-optimized toxic genes | Host cell, E. coli, or packaging cell death, low titers |
요약
벡터 설계 시 적절한 프로모터 선택은 성공적인 유전자 전달을 위해 매우 중요합니다. 프로모터 선택은 벡터 시스템, 이식유전자 유형, 원하는 발현 수준을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 특히 AAV 또는 렌티바이러스 시스템을 사용한 유전자 전달의 경우, 적절한 프로모터는 효율성, 안정성 및 안전성을 향상시켜 실험 성공을 보장하고 의도치 않은 부작용을 방지할 수 있습니다. 여기서 논의된 많은 고려 사항은 Vector Design Studio의 다양한 시스템에 통합되어 있으며, VectorBuilder의 디자인 팀은 항상 도와드릴 준비가 되어 있습니다. 디자인 서포트 의뢰하기
| When using | Promoter recommendation | Key considerations |
|---|---|---|
| AAV | CAG, CBh, EF1α | Avoid silencing in target cell types |
| Lentivirus | CMV, EF1α | Avoid high GC content and recombination |
| Transgene | CMV, CBh | Optimize expression and regulation |
| Marker | PGK | Size can be prioritized |
| Short non-coding RNA | U6 or H1 (Pol III) | Avoid Pol II promoters |
References
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