설계 함정: 렌티바이러스 벡터에서 동일한 프로모터를 사용하는 경우

2개의 유전자 발현 카세트를 렌티바이러스 벡터에 포함시키는 것은 항생제 저항성 유전자 또는 형광 리포터 유전자와 같은 마커 유전자와 관심 유전자(GOI) 발현을 달성하기 위한 일반적인 전략입니다. 그러나 두 카세트 모두에 동일한 프로모터를 사용하는 경우 업스트림 유전자(upstream gene)가 침묵될 수 있습니다. 여기서 우리는 2개의 형광 리포터를 발현하는 일련의 렌티바이러스 벡터를 구성하여 침묵 효과를 입증했습니다.

두 카세트 모두 CMV 프로모터(568bp)에 의해 구동될 때, 업스트림 리포터는 안정적으로 형질도입된 세포의 약 12%에서만 발현되는 반면, 다운스트림 리포터는 세포의 97%에서 발현되었습니다(Fig. 1A). 이 현상은 특정한 리포터 유전자에 의존하지 않았으며, 리포터의 위치를 교환한 경우 업스트림 리포터의 발현율은 14%에 불과했습니다(Fig. 1B). 공통 프로모터의 길이를 연장하고 EF1⍺ 프로모터(1,179 bp)를 사용하는 경우에는 오히려 상황이 악화되어, 업스트림 리포터는 약 1%의 세포에서만 발현되었습니다(Fig. 1C). 대조적으로, 두 리포터에 대해 서로 다른 두 가지 프로모터인 EF1⍺와 CMV를 사용한 경우 각각 96%와 91%의 세포에서 발현되었습니다(Fig. 1D).

이러한 침묵 효과는 렌티바이러스 벡터가 유래한 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 수명주기와 관련이 있을 가능성이 높습니다. 각 HIV-1 비리온에는 숙주 세포에서 역전사(reverse transcription) 과정에서 재결합하는 두 개의 단일 가닥 RNA 게놈이 포함되어 있습니다. 따라서, 동일한 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터에서, 이들 프로모터 사이의 재조합은 업스트림 ORF(open reading frame)의 손실을 초래하여 업스트림 리포터 유전자의 침묵을 초래할 수 있습니다.

프로모터의 동일한 서열 길이가 재조합에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 업스트림 및 다운스트림 카세트에 각각 279bp 공통 영역을 공유하는 CBA 및 CMV 프로모터를 사용했습니다. 이 구성을 통해 형질도입된 세포의 약 32%가 업스트림 유전자를 발현할 수 있었습니다(Fig. 1E). 이는 두 개의 CMV 프로모터(12-14%, Fig. 1A 및 B) 및 두 개의 EF1⍺ 프로모터(4%, 그림 1C)보다 높지만, 두 개의 서로 다른 프로모터를 사용하는 것(96%, Fig. 1D) 보다는 낮습니다. 이러한 결과는 재조합 가능성이 프로모터의 동일한 서열 길이에 비례한다는 것을 시사합니다.

보다 광범위하게, 우리의 결과는 충분한 길이의 모든 동일한 서열이 재조합과 발현 침묵을 유발할 수 있음을 나타냅니다. 예를 들어, EF1⍺와 CMV 프로모터를 사용하여 두 리포터가 정상적으로 발현된 벡터에서는(Fig. 1D), 각 카세트의 프로모터와 리포터 사이에 249-bp의 non-coding stuffer 서열을 삽입했을 때 상류 리포터의 발현이 세포의 96%에서 19%로 감소했습니다(Fig. 1F). 이러한 결과는 렌티바이러스 벡터에서 반복 서열의 악영향을 보여주며, 벡터 설계 시 이러한 서열 반복을 피하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다.

Figure 1. 업스트림 카세트 발현 손실은 렌티바이러스 전달 서열의 잠재적인 재조합에 기인합니다. 293T 세포를 MOI 10에서 렌티바이러스 벡터(A-F)로 형질도입하고 퓨로마이신 선택을 실시했습니다. 안정적으로 형질도입된 세포가 확립된 후, 두 가지 형광 마커의 발현을 FACS를 사용하여 정량화했습니다.

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