CRISPR 방법: 전달 시스템 중에서 선택
Keywords: CRISPR delivery, plasmid, virus, mRNA, RNP
CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템은 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 세포와 동물 모델의 유전자 기능 연구부터 농업용 작물 변형 및 인간의 질병 유발 유전자 편집에 이르기까지 이 접근 방식은 유전자 knockout, knockin, 활성 및 억제를 포함한 광범위한 유전자 변형을 가능하게 합니다. 응용 분야에 관계없이 CRISPR 구성요소를 표적 세포에 도입해야 하며 plasmids, RNA, ribonucleoproteins (RNPs) 및 바이러스를 포함한 다양한 전달 방식을 사용할 수 있습니다(Fig. 1). 이번 게시물에서는 각 CRISPR 전달 시스템의 장단점을 다루며 다양한 실험적 응용에 가장 적합한 방법에 대한 핵심 통찰을 제공합니다. 또한 전임상 및 임상 연구로 전환할 때의 권장 사항도 포함하고 있습니다.
Figure 1. CRISPR/Cas9 전달 방법.
Non-viral CRISPR 전달 시스템
Plasmid 전달
외래 유전 물질을 도입하는 가장 간단하고 저렴한 방법은 플라스미드의 직접 트랜스펙션하는 것입니다. 단일 플라스미드는 Cas9 엔도뉴클레아제와 타겟팅 gRNA를 둘다 인코딩할 수 있으며, 또는 구성요소를 두 개의 서로 다른 벡터로 분리할 수 있습니다. 세포로 들어가면, Cas9의 전사 및 번역과 gRNA의 전사로 인해 유전자 편집 복합체가 형성됩니다. 전사와 번역이 모두 필요하기 때문에, 이 방법은 다른 시스템에 비해 엔도뉴클레아제 활성의 시작이 가장 느리며, DNA의 본질적인 안정성으로 인해 CRISPR 구성 요소가 더 오래 발현됩니다. 이는 DNA가 고차 염색질(chromatin) 구조로 고도로 압축되어 있어 표적 영역에 항상 쉽게 접근할 수 없는 시나리오에서 유용할 수 있습니다. 염색질 리모델링과 같은 자연적 세포 과정은 시간이 지남에 따라 이러한 DNA 영역의 접근성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 느리고 더 긴 과정이 CRISPR 유전자 편집 기계가 타겟 사이트에 충분히 접근할 수 있도록 보장할 수 있습니다. 그러나 이 접근법의 주요 단점은 지속적인 Cas9 발현으로 인한 비표적 사이트에서의 절단으로 인한 오프 타겟 효과(off-target effects) 증가와 플라스미드 DNA가 숙주 게놈에 통합되면서 발생하는 삽입 돌연변이의 위험을 갖고 있습니다.
오프 타겟 효과를 줄이기 위해, 벡터 설계 시 플라스미드 DNA(pDNA) 내 변형을 포함해야 합니다. 예를 들어, Cas9에 degradation signals로 태그하거나 활성을 줄이기 위해 억제 도메인에 결합시킬 수 있습니다. 또 다른 접근법은 빛 또는 화학 시약과 같은 외부 자극에 노출된 후에만 Cas9 단백질이 발현되는 유도 시스템을 사용하는 것입니다. 인기 있는 예로는 tetracycline-inducible system이 있으며, 이는 테트라사이클린이나 그 유사체(예: 독시사이클린, doxycycline)가 존재할 때만 Cas9 발현을 유도하는 테트라사이클린 반응 요소(tetracycline responsive element, TRE) 프로모터를 이용합니다. 동일한 세포 유형에서 여러 편집 실험이 필요한 경우, 테트라사이클린 유도 Cas9(tetracycline-inducible Cas9)을 가진 안정적인 세포주 (stable cell lines)가 최소한의 백그라운도 편집을 제공할 뿐만 아니라 장기적이고 대규모 편집도 가능하게 합니다.
Plasmid 생산은 비교적 간단하고 규모 확대가 가능합니다. 그러나 플라스미드 준비 과정에서 엔도톡신 오염의 위험이 있으며, 박테리아 증폭에 필요한 일부 구성 요소가 숙주 면역을 유발할 수 있어 안전성 문제를 초래할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 소형화된 플라스미드 백본 (e.g. MiniVec™)을 활용하여 플라스미드 백본에 있는 대부분의 박테리아 요소를 제거할 수 있습니다.
바이러스 전달과 달리, 비바이러스 CRISPR 전달 방법은 세포막을 통과하는 데 추가 지원이 필요합니다. 플라스미드의 경우, 물리적 방법(예: electroporation과 microinjection)이나 운반 시스템(예: 지질 나노입자(lipid nanoparticles, LNP)을 사용할 수 있습니다(Fig 2, Tab 1). 이들 중에서 LNP는 임상 적용에 선호됩니다. 물리적 방법에 비해 LNP는 표적 세포에 대한 손상이 훨씬 적고 그 내용물을 보호하는 캡슐을 제공하여 안정성을 향상시키고 혈류 내 순환 시간을 연장합니다. 그러나 전기 천공 및 바이러스 기반 전달과 비교할 때, LNP는 엔도솜 경로에 의존하여 들어가기 때문에 효율성이 훨씬 낮습니다.
DNA 전달의 복잡성과 CRISPR 구성 요소의 플라스미드 전달과 관련된 오프타겟 효과의 위험이 증가함에 따라, 개발 중인 CRISPR 기반 치료법은 이 전달 방법을 사용하지 않습니다. 대신, 플라스미드 전달은 오프타겟 효과를 모니터링할 수 있는 표적 세포가 있는 경우, 간단하고 비용 효율적인 특성 때문에 연구 기반 응용에 더 적합한 선택입니다.
RNA 전달
CRISPR 구성 요소를 RNA(Cas9 mRNA 및 gRNA)로 전달하는 것은 플라스미드 전달에 비해 더 효율적인 접근 방식입니다. 이는 전사를 우회하고 세포질에서 즉시 Cas9의 번역을 시작할 수 있습니다. 이 전달 방식은 RNA의 고유한 불안정성으로 인해 숙주 내에서 빠르게 분해되어 CRISPR 구성 요소의 일시적 발현을 유도하므로, 특히 단기 실험에 적합합니다. 전반적으로 이는 특이성을 높이고, 오프타겟 효과(off-target effects)를 증가시킬 수 있는 장기적인 Cas9 발현을 방지하여 DNA보다 더 안전하다고 간주됩니다. 또한, 삽입 돌연변이의 위험이 없습니다. mRNA는 세포 없이 생산될 수 있으므로, 생산 중 오염 위험이 낮다는 장점이 있습니다. 그러나 RNA 제조 공정은 pDNA 생산에 비해 비용이 더 많이 들고 기술적으로 복잡하여 대규모 생산이 더욱 어렵습니다.
pDNA와 마찬가지로, mRNA도 미세 주입, 전기 천공 및 LNP로 전달될 수 있습니다(Table 1). Therapeutic RNA의 경우, LNP 기반 전달이 효과적인 접근 방식으로 입증되었으며, 화이자(Pfizer)와 모더나(Moderna) 코로나19(COVID-19) 백신 모두 이 전략을 사용했습니다. 향후 CRISPR mRNA LNP 치료의 가능성은 트랜스티레틴 아밀로이드증(Transthyretin Amyloidosis, ATTR)을 치료를 목표로 하는 약물의 1상 임상 시험에서 반영되었습니다. 특히, 이 치료법은 in vivo에서 효과가 있는 반면, 현재 승인된 치료법은 ex vivo 변형에 의존하는데 이는 시간과 노동면에서 더 제한적이고 비용이 많이 듭니다.
RNP-기반 전달
CRISPR 구성 요소의 가장 효율적인 비바이러스 전달 방법은 RNP를 이용하는 것입니다. 전사와 번역이 필요 없기 때문에 Cas9 단백질과 gRNA는 즉시 핵으로 들어가서 게놈 편집을 시작할 수 있습니다. 또한, RNA와 마찬가지로 게놈 통합의 위험이 없고 발현이 일시적이므로 오프타겟 효과를 최소화할 수 있습니다. 그러나 RNPs는 프로테아제(proteases)에 의해 분해되기 쉬워 플라스미드 및 mRNA에 비해 이 전달 방법의 안정성이 낮아 임상 환경에서 취급 및 보관에 어려움을 초래합니다. 또한, RNP의 생산은 pDNA와 mRNA에 비해 노동 집약적이고 비용이 많이 들며, 단백질 생산 중 독성 오염 물질의 위험이 증가하여 임상 적용에 대한 안전성 문제가 발생할 수 있습니다.
RNP 전달의 가장 효율적인 방법은 전기천공법(electroporation)이며, ex vivo 유전자 편집과 생쥐 배아의 유전체 공학에서 성공적이었습니다. 그러나 RNP를 포함한 LNP의 정맥 주사는 CRISPR 구성 요소를 근육, 뇌, 폐 및 간으로 표적 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다.
RNP 기반 CRISPR 치료법은 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia) 치료를 위한 최초의 CRISPR 기반 약물인 Casgevy가 승인을 통해 지금까지 가장 큰 임상 성공을 보여주었습니다. 이 약물은 RNP인 CRISPR 구성 요소를 체외(ex vivo)에서 환자 세포에 전기천공한 후, 편집된 세포를 선별하여 환자에게 다시 수혈하는 방식으로 작동합니다.
Figure 2. CRISPR 구성요소의 비바이러스 전달 방법.
| Delivery Method | Delivery Modality | Advantages | Disadvantages |
|---|---|---|---|
| Electroporation | DNA, mRNA or RNP | Highly efficient, works on a broad range of cell types | Damaging to cells |
| Microinjection | DNA, mRNA or RNP | Efficient on a single cell level with large cargo carrying capacity | Technically demanding and damaging to cells |
| LNPs | DNA, mRNA or RNP | History of approval by FDA | Low and variable efficiency depending on cell type |
Table 1. CRISPR 구성요소 전달의 비바이러스 방법 비교.
바이러스 전달
바이러스 벡터는 CRISPR 구성 요소를 세포로 쉽게 전달할 수 있는 인기 있는 옵션입니다. 이는 분화된 세포를 포함하여, 트랜스펙션이 어려운 세포에 특히 유용합니다. 유형에 따라 효율적인 생체내 형질도입을 위해 바이러스를 활용할 수도 있습니다. 바이러스 전달 시스템을 사용하는 것은 주로 비용과 복잡한 생산 프로세스로 인해 상당한 어려움이 따릅니다. 바이러스 벡터 생산을 위해서는, CRISPR 구성 요소를 전달 벡터에 클로닝한 후, 구조물을 바이러스 입자로 패키징하는 추가 단계가 필요합니다. 이 노동 집약적인 생산 과정은 비바이러스 벡터 생산에 비해 규모 확대를 더 어렵게 만듭니다. 렌티바이러스, AAV, 그리고 아데노바이러스는 CRISPR 기반 유전자 편집에서 가장 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터이며, 각각의 시스템은 특정 실험 목표에 따라 적합성을 결정할 수 있는 뚜렷한 장점과 단점을 제공합니다(Table 2).
| Delivery Method | Efficiency | Stability | Clinical Safety | Recommended Applications |
|---|---|---|---|---|
| Lentivirus | High | Low (storage in -80℃ ~6 months) |
Moderate (WT virus insertional mutagenesis) |
In vitro and ex vivo |
| AAV | Moderate | Moderate (storage in -80℃ ~1 year) |
High | In vivo |
| Adenovirus | Moderate | Moderate (storage in -80℃ ~1 year) |
Moderate (high immunogenicity) |
In vivo |
Table 2. 바이러스 기반 CRISPR 전달 방법의 비교. 주요 장점은 녹색으로 강조되고 주요 단점은 빨간색으로 강조 표시됩니다.
Lentivirus-기반 전달
Lentivirus는 전기천공법과 유사한 높은 유전자 전달 효율을 가지고 있어, 대규모 스크리닝을 위한 CRISPR 라이브러리를 포함한 CRISPR 구성 요소의 전달에 매우 인기가 있습니다. 이 전달 시스템은 바이러스 화물이 숙주 게놈에 삽입되어 장기 발현을 가능하게 하므로, 많은 과발현 실험에 도움이 될 수 있기 때문에 매력적입니다. 그러나 삽입 돌연변이의 위험과 같은 안전 문제로 인해 in vivo 임상 사용이 제한됩니다. 대신, 렌티바이러스 벡터는 주로 연구 또는 ex vivo 수정에 사용됩니다. 이 접근 방식은 FDA 승인 치료제의 성공적인 개발로 이어졌으며, 암 치료용 CAR-T와 베타 지중해빈혈 치료를 위한 Zynteglo의 성공적 개발로 이어졌습니다. CRISPR 구성 요소의 전달에 있어서, 렌티바이러스는 Cas9의 지속적인 발현과 관련된 오프타겟 효과로 인해 문제가 될 수 있습니다. 그러나 이는 유도성 발현 시스템이나 삽입효소 결핍 렌티바이러스(integrase-deficient lentivirus, IDLV)를 사용하여 완화될 수 있으며, 이는 통합 비율을 약 500배까지 감소시킵니다. 비록 IDLV는 일반적으로 통합 가능 렌티바이러스에 비해 낮은 형질도입 효율을 보이지만, in vitro 와 in vivo 모두에서 후기 분열 신경 세포에서 유사한 효율을 보여주었습니다. 이는 IDLV가 향후 임상 적용, 특히 중추 신경계를 대상으로 하는 적용에 특히 유용할 수 있음을 시사합니다.
AAV-기반 전달
CRISPR-기반 AAV 치료제는 낮은 면역원성과 삽입 돌연변이의 위험이 낮다는 이유로 특히 in vivo 적용에 유망합니다. 실제로, CRISPR 구성 요소를 전달하는 AAV9의 정맥 투여는 마우스와 영장류 모델에서 HIV 치료에 성공적인 것으로 입증되었습니다.
AAV를 유전자 전달 벡터로 사용하는 주요 한계는 매우 제한된 화물 용량(~4.2 kb)과 렌티바이러스에 비해 낮은 형질 도입 효율입니다. 낮은 화물 용량을 보완하기 위해 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus, SaCas9)에서 유래한 더 작은 Cas9을 사용하거나, Cas9과 gRNA를 별도의 벡터로 전달할 수 있습니다. 또 다른 전략은 SpCas9을 gRNA가 포함된 두 개의 별도 벡터로 나누어 형질 도입 후에 전체 Cas9 단백질이 조립되도록 하는 것입니다.
몇 가지 분명한 단점에도 불구하고 AAV는 특정 조직을 표적화할 수 있는 다양한 혈청형을 사용할 수 있다는 점에서 매우 유리합니다. AAV capsid evolution을 통해 새로운 캡시드 변이체를 생성하는 것도 가능하며, 이로써 AAV 캡시드 돌연변이가 향상된 표적화 및 치료 특성을 위해 in vitro와 in vivo에서 생성되고 스크리닝 됩니다.
현재 FDA 승인을 받은 AAV 기반 CRISPR 치료법은 없지만, HIV 치료를 위해 정맥 투여되는 약물 EBT-101의 1/2상 임상시험이 완료되었습니다. 또한, 척수성 근위축증 치료를 위한 Zolgensma와 같이 유전자 과발현을 활용하는 여러 AAV 기반 치료제가 이미 사용되고 있습니다.
Adenovirus-기반 전달
Adenovirus-기반 전달은 일반적으로 렌티바이러스보다 안전한 것으로 간주되며, 수많은 임상 시험에서 강력한 안전성 이 입증되었고 게놈 통합 위험이 없습니다. 렌티바이러스와 AAV에 비해 아데노바이러스는 더 큰 운반 용량을 가지고 있지만, 높은 면역원성은 유전자 편집 효율을 저해할 수 있습니다. 가장 많이 사용되는 혈청형인 인간 아데노바이러스 5형(human adenovirus 5, Ad5)은 제한된 감수성을 가지고 있어, 콕사키와 아데노바이러스 수용체(coxsackie and adenovirus receptor, CAR)를 발현하는 세포에만 효율적인 형질 도입이 가능합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 Ad5/F35와 같은 Ad5의 변형체가 개발되었으며, 키메라 아데노바이러스는 CAR 수용체가 결여된 세포의 감염을 가능하게 합니다. 면역원성을 줄이기 위해 포장에 필수적인 바이러스 서열만 포함한 거트리스 아데노바이러스(gutless adenovirus)를 사용할 수 있으며, 이로 인해 운반 용량을 33 kb로 늘릴 수 있는 추가적인 장점이 있습니다.
임상시험으로의 전환은 유전 질환과 암을 포함한 다양한 질병을 표적으로 하는 많은 잠재적 아데노바이러스 기반 CRISPR 치료제에 유망해 보입니다. 마우스 실험에서 아데노바이러스가 in vivo 치료에 적합하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 FDA가 아데노바이러스 유전자 치료제를 승인했음에도 불구하고, 아데노바이러스 기반 CRISPR 치료제는 아직 FDA 승인을 받지 못했습니다.
요약
CRISPR 구성요소나 다른 유전 물질을 전달하기 위한 최적의 시스템을 선택하는 것은 다양한 비바이러스 및 바이러스 옵션이 존재하기 때문에 어려울 수 있습니다. 궁극적으로 최상의 선택은 실험 목표에 따라 다르며, 발현이 장기적이어야 하는지 일시적이어야 하는지, 실험이 in vitro 또는 in vivo에서 수행되는지, 임상으로 전환할 목표가 있는지 등의 다양한 요인을 신중히 고려해야 합니다(Tab 3). 또한, CRISPR 전달 벡터를 설계하고 생산하는 것은 기술적으로 까다롭고, 시간과 비용이 많이 드는 작업입니다. 다행히도, VectorBuilder는 다양한 비바이러스 및 바이러스 벡터 시스템을 사용한 풍부한 경험을 가지고 있으며, 초기 설계 단계부터 임상 단계까지 지원할 수 있습니다. 최근의 임상 시험과 첫 번째 CRISPR 약물 허가는 유전자 전달의 힘을 활용하여 다양한 질병을 치료할 수 있는 매우 효과적인 CRISPR 기반 약물 개발의 잠재력을 보여줍니다.
| Delivery System | Efficiency | Main Delivery Techniques | Stability | Production | Cost | Clinical Safety | FDA Approved CRISPR Drug | Best Choice For |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Plasmid | Low | Electroporation Microinjection LNPs |
High | Simple and scalable | Cheap | Low (contamination and off-target effects) |
× | Gradual prolonged gene editing in vitro |
| mRNA | Moderate | Electroporation Microinjection LNPs |
Low (degradation by RNases) |
Moderately scalable | Moderate | High (transient expression reduces off-target effects) |
× | Fast and brief gene editing in vitro or in vivo |
| RNPs | High | Electroporation Microinjection LNPs |
Low (degradation by proteases) |
Low scalability | High | High (transient expression reduces off-target effects) |
Casgevy | Fast and brief gene editing and ex vivo clinical applications |
| Viral | High (depending on viral vector used) |
Direct viral transduction | Moderate (depending on virus) |
Laborious with low scalability | Very high | Dependent on virus (immunogenicity and risk of off-target effects) |
× | For difficult to transfect cells and clinical applications |
Table 3. CRISPR 구성 요소 전달의 다양한 방식 비교. 주요 장점은 녹색으로 강조되고 주요 단점은 빨간색으로 강조됩니다.
Sources
Lino CA, Harper JC, Carney JP, Timlin JA. Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1234-1257.
Kazemian P, Yu SY, Thomson SB, Birkenshaw A, Leavitt BR, Ross CJD. Lipid-Nanoparticle-Based Delivery of CRISPR/Cas9 Genome-Editing Components. Mol Pharm. 2022 Jun 6;19(6):1669-1686.
Fajrial AK, He QQ, Wirusanti NI, Slansky JE, Ding X. A review of emerging physical transfection methods for CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Theranostics. 2020 Apr 15;10(12):5532-5549.
Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich Lächelt. Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP. Biomater. Sci., 2022, 10, 1166-1192.
Hou, X., Zaks, T., Langer, R. et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater 6, 1078–1094 (2021).
Bloomer H, Khirallah J, Li Y, Xu Q. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated genome and epigenome editing in mammalian cells. Adv Drug Deliv Rev. 2022 Feb;181:114087.
Yip BH. Recent Advances in CRISPR/Cas9 Delivery Strategies. Biomolecules. 2020 May 30;10(6):839.
Dong W, Kantor B. Lentiviral Vectors for Delivery of Gene-Editing Systems Based on CRISPR/Cas: Current State and Perspectives. Viruses. 2021 Jul 1;13(7):1288.
Zhang S, Wang Y, Mao D, Wang Y, Zhang H, Pan Y, Wang Y, Teng S, Huang P. Current trends of clinical trials involving CRISPR/Cas systems. Front Med (Lausanne). 2023 Nov 10;10:1292452.
Boucher P, Cui X, Curiel DT. Adenoviral vectors for in vivo delivery of CRISPR-Cas gene editors. J Control Release. 2020 Nov 10;327:788-800.
National Library of Medicine. National Centre for Biotechnology Information. ClinicalTrials.gov. https://clinicaltrials.gov/search?intr=crispr