내 박테리아 발현벡터는 왜 재조합 단백질을 발현하지 않을까요?

The plasmid is placed in an inappropriate host strain

Induction하기에 부적합한 host strain에서는 plasmid가 발현되지 않을 수 있다. VectorBuilder의 벡터는 클로닝 host strain Stbl3에서 E. coli stock으로 되어있다(이 정보는 벡터 리포트에도 기재됨). Stbl3는 plasmid의 안정성을 유지하는 능력 때문에 선호되는 클로닝 호스트지만, 재조합 단백질 발현에는 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, pET의 경우 IPTG-induced 재조합 단백질 발현에서는 T7 RNA polymerase가 필요한 반면, Stbl3에는 존재하지 않는다. 이와 같이 박테리아 발현 벡터는 적절한 induction을 위해 일반적으로 BL21(DE3)과 같은 적절한 host strain으로 plasmid를 옮겨야 한다.

The protein expressed on the vector is “problematic”

때로는 발현되고 있는 단백질이 용해되지 않거나 잘못 접히거나 부적절하게 갈라지거나 박테리아 호스트에 독성이 있을 때, 재조합 단백질의 빈약한 induction이 나타날 수 있다. 이 경우 induction 시스템을 최적화하거나(아래 참조), 보다 내성이 있는 host strain이나 대체 가능한 발현 벡터에서 목적 유전자를 발현해야 한다.

Your induction system is not optimized

발현될 유전자, 발현 벡터, host strain에 따라 induction 시스템에서 다음과 같은 것들을 최적화하는 것을 고려해야 한다. OD600(일반적으로 0.6 ~ 0.8); inducing agent의 농도(예: IPTG 또는 L-arabinose)는 너무 낮거나 너무 높으며 안됨; induction 지속시간은 너무 짧거나 길면 안됨; induction 온도는 특히 "문제적" 단백질을 다룰 때 최적화되어야 하며, 다른 온도(예: 16°C, 25°C, 30°C, 37°C 등)에서 테스트. 드문 경우지만, 불분명한 이유로 같은 발현 벡터의 다른 클론이 서로 다른 induction 작용을 보일 수 있기 때문에, 개별적으로 테스트할 단일 콜로니를 여러개 선택하여 induction 성과가 가장 좋은 콜로니를 선택해야 할 수도 있다.

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