내가 측정한 바이러스 titer가 VectorBuilder에서 제공한 것과 다른 이유는 무엇일까요?

서로 다른 사람이 측정한 바이러스 titer의 불일치는 사용하는 titration 방법의 차이 또는 바이러스 분해로 인한 측정값 간의 차이에서 일반적으로 발생한다. VectorBuilder는 다양한 유형의 바이러스에 대해 서로 다른 titration 방법을 사용한다. VectorBuilder에서 바이러스 titer를 결정하는 방법에 대한 자세한 내용은 FAQ 항목 “VectorBuilder에서는 바이러스 titer를 어떻게 결정하는가?”을 참조하세요.

실험실에서 수행한 바이러스 titer 측정 결과가 VectorBuilder에서 제공한 결과와 크게 다를 경우, 사용된 분석 방법이 다르기 때문일 수 있다. 예를 들어, VectorBuilder에서 우리는 lentivirus titer를 결정하기 위해 p24 ELISA 방법을 사용하는 반면, 일부 연구소는 lentivirus RNA를 직접 측정하기 위해 가격적으로 저렴한 qPCR 기반 방법을 사용하는 것을 선호한다. 또한 일부 연구소는 FACS에 기반한 분석이나 콜로니 형성 단위의 정량화와 같은 간단한 방법을 선호한다. 각 방법마다 장단점이 있고, lentivirus titer에 대해 얻어진 값은 방법마다 크게 다를 수 있다.

유사한 유형의 titration 분석을 비교한 경우, 다른 실험 모델의 사용, 사용된 시약의 차이 또는 사용된 실험실 장비의 민감도 이슈 등과 같은 다른 요인에 의해 titer 측정에서 여전히 불일치가 있을 수 있다. 일반적인 예로는 lentivirus와 함께 polybrene을 부적절하게 사용하거나 (polybrene은 특정 세포 유형에 독성이 있을 수 있음), 테스트된 바이러스에 의해 효율적으로 감염되지 않는 cell lines이나 종을 사용하여 바이러스 titer를 측정하는 경우가 있다. 또 다른 잠재적인 문제는 시약이나 검출 장비(예: 현미경)가 단일 바이러스가 통합되는 것을 식별하기에 충분히 민감하지 않은 경우 바이러스 titer가 과소 측정될 수 있다는 것이다. 때때로 titer 측정 프로토콜의 작은 기술적인 사항이 바이러스 titer 값에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, AAV titer는 바이러스 스톡에서 바이러스 게놈의 카피 수를 정량화하기 위해 보통 qPCR 기반 방법을 사용하여 결정되며, qPCR 프라이머에 대한 타겟 위치의 선택은 AAV titer의 정확한 판단에 매우 중요하다. 당사의 AAV titration 방법에서 qPCR 프라이머는 현장에서 가장 일반적으로 선택되는 AAV ITR을 타겟으로 설계되었다. ITR-specific프라이머를 사용하여 얻은 바이러스 titer는 ITR 사이의 영역과 같은 다른 위치를 타겟으로 한 프라이머를 사용하여 얻은 titer 값과 다를 수 있다. 이는 ITR에서 2차 구조가 존재하여 발생하는 virus ITR의 증폭 역학과 ITR 사이의 영역에서의 증폭 역학이 다르기 때문이다. 마찬가지로 프라이머 annealing 온도 및 annealing 효율과 같은 프라이머 annealing 조건도 AAV titer 값에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

Titration 방법 외에도 보관 및 취급 조건에 대한 바이러스 스톡의 sensitivity는 또한 titer 측정의 불일치를 야기할 수 있다. Enveloped 바이러스는 동결-융해 사이클을 반복하거나 -80°C 이상에서 저장하면 감염성이 빠르게 상실되는 경향이 있다. 핵산을 손상시키거나 detergents나 nuclease와 같은 단백질 구조에 영향을 미치는 버퍼 컴포넌트와 조성 또한 바이러스 감염성을 손상시킬 수 있다. 또한 바이러스 prep의 순도는 바이러스 안정성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 AAV와 adenovirus는 lentivirus, unpurified AAV 및 unpurified adenovirus에 비해 안정성이 높지만, proteases에 의해 분해되기 쉬운 것으로 밝혀져, 그 결과 동결-융해가 반복된 후 낮은 titer를 보일 수 있다.

바이러스 벡터를 활용할 연구 계획을 세울 때, 자신의 실험 모델에서 그 벡터를 테스트하고 최적화할 것을 강력히 추천한다. 왜냐하면 이것은 본인 연구에 특정한 실험 조건 하에서 각 벡터 시스템이 어떻게 작동할 것인가에 대한 최상의 지표를 제시해 줄 것이기 때문이다.