나의 형광 단백질은 왜 이렇게 흐릿한가요?

세포는 일반적으로 약물에 대한 내성을 얻기 위해 drug resistance유전자의 낮은 발현에서 중간 정도의 발현만 필요로 한다. 한편, 형광 단백질(FP)의 경우 밝은 형광 시그널을 얻기 위해서는 높은 수준의 발현이 필요한 반면, 낮은 발현에서 중간 발현에서는 약한 시그널 또는 장비의 검출 가능한 임계값 아래의 시그널만 생성될 수 있다. 또한 특정 FP(예: EBFP)는 일반 FP(예: EGFP)보다 훨씬 어둡고, 특히 검출이 어렵다. 실제로 일부 연구자들은 세포배양이나 in vivo에서 목적 FP를 시각화하기 위해 anti-FP 항체를 이용한 immunofluorescence에 의존해야 했다. 빈약한 형광의 주요 원인은 다음과 같다.

The FP gene is driven by a weak promoter

일부 promoters (예: UBC)는 내재적으로 약해 그 결과 FP의 발현이 낮아질 수 있다. 다른 promoters (예: CMV)는 세포 배양에서 잘 작동할 수 있지만 때때로 in vivo에서 작동하지 않을 수 있다. FP를 발현할 때는 가능하면 강력한 유비쿼터스 promoter (예: EF1A 또는 CAG)를 사용해야 한다. Tissue-specific promoter를 사용해야 하는 경우 가능하면 강력한 promoter도 선택해야 한다. 약한 promoter나 특성이 떨어지는 promoter를 사용해야 한다면 FP시그널이 불충분할 가능성에 대비해야 한다. 이 경우 FP가 발현되지 않는 것은 아니다. 그것은 단지 고도로 발현되지 않은 것일 수 있다. RT-PCR이나 immunofluorescence와 같은 보다 민감한 분석법을 사용하여 FP 발현을 확인할 수 있다.

The FP gene is expressed from lentivirus or MMLV

Retrovirus 벡터 시스템(예: lentivirus 또는 MMLV)의 경우 internal polyadenylation signals이 LTR 사이에 존재할 수 없으며, 이는 바이러스 패키징을 억제할 수 있기 때문이다. 대신에 3'LTR에 single polyadenylation signal이 존재한다. 그 결과, upstream promoter로부터의 전사는 upstream ORF의 끝을 지나 downstream promoters 및 ORF를 통해 지속되는 경우가 있다. 이는 종종 downstream ORF의 부분적 발현 억제로 이어진다. Downstream ORF가 FP일 때, 그 발현은 훨씬 줄어들 수 있다. FP 유전자 발현을 다음과 같이 개선할 수 있다.

일반 plasmid, adenovirus또는 AAV와 같은 다른 벡터 시스템을 사용하는 것을 고려해 보세요.

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보다 밝은 FP variant (예: EGFP 대신 TurboGFP 사용)를 고려해 보세요.

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Polycistron의 일부로 upstream expression cassette에 FP 유전자를 발현하는 것을 고려한다. 2A linker를 사용하여 목적 유전자에 FP 유전자를 연결할 수 있다. 그러나 이는 polycistron에서 다른 ORF의 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 여전히 낮은 형광(아래 참조)을 초래할 수 있고, 벡터 제작의 비용과 시간을 증가시킬 것이다.

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The FP gene is expressed in a polycistron

융합 단백질은 거의 융합되지 않은 것보다 형광이 약하다(예: EGFP/Neo 융합 단백질은 EGFP 단독보다 형광이 약하다). 또한 검증되지 않은 융합 단백질은 세포 내에서 불안정하거나 잘못 접히거나 기능하지 않을 가능성이 있다. 만약 이것이 약한 형광의 원인이라고 의심한다면, 다음을 시도해 볼 수 있다.

The FP gene is downstream of an IRES.

하나 이상의 IRES elements를 포함하는 polycistronic transcript에서, IRES의 downstream ORF는 polycistron의 upstream ORF에 비해 훨씬 낮은 수준(일반적으로 10-20%)으로 발현된다. 만약 FP가 IRES downstream에서 발현된다면, 이러한 발현 감소는 형광 불량으로 이어질 수 있다. FP를 polycistron의 downstream 위치로 발현해야 하는 경우 IRES 대신 2A self-cleaving linker (예: P2A 또는 T2A)를 사용하는 것을 고려해 볼 수 있다. 2A를 사용함으로써 polycistronic transcript의 downstream ORF는 대개 upstream ORF에 상당(또는 적당히 낮은) 수준으로 발현된다. 그러나 2A에는 목적 유전자(GOI)의 기능을 구성할 수 있는 위험도 있다. 복수의 2A가 존재할 경우, downstream ORF도 낮은 레벨에서 표현되는 경향이 있다. 또한, 2A self-cleavage는 100% 효율적이지 않으며, 효율성은 upstream 및 downstream ORF의 시퀀스 컨텍스트에 의해 강하게 영향을 받을 수 있다. 이와 같이 polycistron의 translation 산물 중 상당 부분은 self-cleave에 실패한 융합 단백질일 수 있으며, 이는 일부 응용에서 문제가 될 수 있다. 더욱이 2A linker의 cleavage는 upstream 단백질의 C 말단에 여분의 짧은 펩타이드와 downstream 단백질의 N 말단에 여분의 proline을 남겨둔다. 이것은 대부분의 응용에서 문제가 되지 않지만, 어떤 상황에서는 단백질 기능으로 구성될 수 있다.

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The FP gene is part of a fusion protein.

융합 단백질은 거의 융합되지 않은 것보다 형광이 약하다(예: EGFP/Neo 융합 단백질은 EGFP 단독보다 형광이 약하다). 또한 검증되지 않은 융합 단백질은 세포 내에서 불안정하거나 잘못 접히거나 기능하지 않을 가능성이 있다. 만약 이것이 약한 형광의 원인이라고 의심한다면, 다음을 시도해 볼 수 있다

더 강력한 promoter (예: EF1A)를 사용하여 융합 유전자의 발현을 유도하는 것을 고려하세요.

융합되지 않은 형태로 형광 단백질을 발현하는 것을 고려해 보세요.

보다 밝은 FP variant (예: EGFP 대신 TurboGFP 사용)을 고려해 보세요.

FP를 GOI와 연결하기 위해 linker를 추가하거나, 기존에 사용하는 것과 다른 linker를 사용해 보세요.

FP 및 GOI의 위치 전환을 고려해 보세요.

The inherent brightness of the FP gene is low

일부 FP는 같은 색상 계열의 다른 변종보다 원래 더 어둡다. 예를 들어 blue 계열에서 EBFP의 밝기는 TagBFP의 약 1/3에 불과하다. 형광 리포터에 대한 가이드를 바탕으로 좀 더 밝은 FP variant를 선택해 보기를 제안한다.