어떤 형광 단백질을 사용해야 하나?

수년에 걸쳐 많은 형광 단백질(FP)이 개발되었으며, 어떤 FP를 실험에 사용할지는 많은 요인에 따라 달라진다.

Single-color experiments

Single-color 실험의 경우 green FP가 가장 일반적으로 선택된다. EGFP는 가장 많이 쓰는 green FP로 많은 single-color 연구에 사용된다. 그러나 TurboGFP(maxGFP)와 같은 다른 green FP는 특정 용도에 더 나은 선택이 될 수 있다. 예를 들어 TurboGFP는 EGFP에 비해 더 밝은 green 형광성, 더 빠른 maturation, 높은 pH-안정성 및 광-안정성 등 더 고급 기능을 가지고 있어, 조기 신호 검출과 고감도의 이점을 얻을 수 있는 실험에 이상적이다. 만약 red FP를 선호한다면, monomer 구조와 좋은 형광 특성, 낮은 독성으로 갖고 있는 mCherry가 대부분의 실험에서 좋은 선택이 된다. 특히 단백질 tagging에 적합하고, 세포가 다른 red FP에서 발생할 수 있는 독성 또는 단백질 aggregation에 민감한 경우에 적합하다. 더 밝은 dTomato는 dimerization과 FP의 일부 잠재적 aggregation이 허용되는 상황에서 잘 작동한다. 또 다른 좋은 red FP는 DsRed_Express2로 red FP의 최소 세포독성 버전이다.

Multicolor experiments

여러 개의 fluorophores (FP 및 DAPI와 같은 다른 dye 포함)을 동시에 사용하는 다색 실험의 경우 fluorophores의 스펙트럼 특성을 주의 깊게 고려하여, 사용 가능한 현미경, flow cytometer 또는 형광 검출에 사용되는 다른 장비에서 excitation 및/또는 emission 필터에 기초하여 스펙트럼을 구별할 수 있는지를 확인해야 한다. 기본적으로 검출 장비는 다른 fluorophores의 간섭 없이 실험에 사용된 여러 개의 fluorophores의 형광 시그널을 각각 판독할 수 있어야 한다. 이는 목적하는 fluorophore 만 자극하는 적절한 frequency의 excitation 빛을 생산하는 excitation 필터(또는 레이저)를 사용하여 할 수 있다. 또한 목적 fluorophore에서 방출된 형광 빛만 검출기에 들어갈 수 있도록 emission 필터를 사용해서도 수행할 수 있다. 두 가지 색상의 경우 EGFP와 같은 표준 green FP와 mCherry와 같은 표준 red FP는 사실상 모든 형광현미경 및 flow cytometer에 잘 적용될 것이다. 세 가지 색상의 경우 blue, green 및 red FP 조합(예: TagBFP + EGFP + mCherry) 또는 cyan, yellow 및 red 조합(예: CyPet + YPet + mCherry)은 대부분의 형광 현미경이나 flow cytometer에서 쉽게 분리할 수 있어서 잘 작동할 수 있다.

Fluorescence resonance energy transfer (FRET)

FP는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 기반 응용에 널리 사용된다. FRET은 excited donor chromophore 분자가 nonradioactive dipole-dipole coupling을 통해 acceptor chromophore에게 에너지를 전달하는 물리적인 과정이다. 관찰 결과, FRET은 donor의 fluorescence 감소와 acceptor의 emission 증가로 이어진다. FRET에는 몇가지 전제조건이 있다: donor와 acceptor가 가까운 곳에 있어야 한다(10-100 å). Acceptor의 excitation 스펙트럼은 donor의 emission 스펙트럼과 중복되어야 한다. Donor와 acceptor의 transition dipole orientations은 평행해야 한다. FRET은 거리에 따라 달라지며 FRET의 효율은 donor와 acceptor사이의 거리의 6승에 반비례한다. 따라서 거리의 작은 변화에 매우 민감하여 DNA나 단백질 구조를 연구하고 분자 상호작용을 연구하는 등 여러 응용 분야에서 강력한 도구가 된다. cyan-yellow donor/acceptor pair, CyPet-YPet은 dynamic range가 좋아 FRET 기반 방법에 자주 사용된다.

Our recommendations:

Single Color: EGFP, TurboGFP, mCherry, dTomato, or DsRed_Express2 (These FPs can be used with DAPI.)

Two-color: EGFP + mCherry or TurboGFP + mCherry (These pairs can be used with DAPI.)

Three-color: TagBFP + EGFP + mCherry or CyPet + YPet + mCherry (The second combination can be used with DAPI when proper filters are used.)

FRET-based applications: CyPet - YPet

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