Polycistronic expression cassette에 IRES 또는 2A (어떤 2A) 중 무엇을 사용해야 할까요?

단일 promoter의 조절하에 복수의 ORF를 공동 발현하도록 유전자 발현 벡터를 디자인할 때, IRES (internal ribosome entry site) 또는 2A family peptides와 같은 linkers로 구분하여 promoter 뒤에 여러 ORF를 배치합니다. 이들 linker로 의해 하나의 mRNA transcript에서 여러 개의 단백질이 생성될 것입니다.

Mechanisms

가장 일반적으로 사용되는 IRES element는 encephalomyocarditis virus (EMCV)에서 유래합니다. Primary translation initiation site 외에 mRNA의 내부 영역에서 translation 개시가 일어날 수 있도록 추가 ribosome recruitment site 역할을 함으로써 기능합니다.

2A 펩타이드들은 바이러스로부터 유래된 짧은 (약 18-25aa) 펩타이드들입니다. 이들은 보통 'self-cleaving' 펩타이드라고 부르는데, 이 펩타이드들은 동일 transcript에서 여러 단백질을 생성합니다. 2A 펩타이드들은 ribosome이 2A element의 C-말단 끝에서 glycine과 proline 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰게 하여, 2A 서열의 끝과 downstream 펩타이드를 분리하게 하는 기능을 하기 때문에 전부 'self-cleave' 되지는 않습니다. 그 결과, upstream 단백질은 C 말단에 2A 잔류물이 몇개 더 추가되는 반면, downstream 단백질은 N 말단에 추가적인 proline이 있습니다. 흔히 사용되는 4가지 2A 펩타이드(P2A, T2A, E2A, F2A)가 있고, 이들은 각기 다른 바이러스로부터 유래된 것입니다.

Pros and cons of the two types of linkers

IRES의 장점은 upstream 또는downstream ORF의 단백질 서열에 영향을 주지 않는다는 것인데, 2A의 경우는 그렇지 않습니다.

IRES의 단점은 polycistron의 upstream ORF에 비해 downstream ORF가 훨씬 낮은 수준 (일반적으로 10~20%)으로 발현된다는 점입니다. 이 때문에 IRES 뒤에 형광단백질을 발현할 때 종종 검출 가능한 형광 시그널을 얻는데 어려움을 겪는 경우가 있고, 특히 세포당 transgenes 수가 제한된 in vivo 적용에서 시그널을 얻는데 어렵습니다. IRES elements는 사이즈 (>500bp) 때문에 문제가 생길 수 있고, 이는 벡터 제작과 바이러스 패키징의 난이도가 높아집니다.

IRES에 비해 2A의 장점은 downstream ORF가 upstream ORF에 비해 상당(또는 약간 낮은) 수준으로 발현될 수 있다는 것입니다.

2A의 단점은 upstream 또는 downstream ORF에 추가된 펩타이드로 원치 않는 생물학적 효과가 발생할 가능성이 있다는 것입니다. 또한, 2A self-cleavage는 100% 효율적이지 않으며, 이 효율성은 upstream 및 downstream ORF의 서열 컨텍스트에 의해 강하게 영향을 받습니다. 이와 같이 polycistron의 translation 산물 중 상당 부분은 self-cleave가 실패한 fusion protein일 수 있으며, 이는 일부 적용에서 문제가 될 수 있습니다.

실험에서 bicistron의 두번째 ORF(예: drug-selection marker)를 높은 수준으로 발현할 필요가 없다면, IRES로 충분합니다. 그러나, polycistron에 ORF가 2개 이상 있거나, 다수의 ORF 발현양이 동등한 수준일 것이 중요한 경우에는, 2A 펩타이드 사용을 권장합니다.

Comparison of different 2A peptides

일반적으로 사용되는 4개의 2A 펩타이드(P2A, T2A, E2A, F2A) 중에서 P2A가 일반적으로 가장 높은 cleavage 효율을 보이는 것으로 나타났습니다(일부 경우에는 100%에 가깝다). 다음으로 T2A, 그 다음은 E2A, F2A 입니다. F2A의 cleavage 효율은 약 50%에 불과합니다. 일반적으로 polycistron에서 P2A나 T2A를 사용하는 것을 추천합니다.

References
References Topic
Biotechniques. 41:283 (2006) Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors
PLoS One. 6:e18556 (2011) Cleavage efficiency of 2A linkers in human cell lines, zebrafish and mice

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