Recombinant Protein Production

VectorBuilder는 단백질 구조 분석, enzymatic assay개발, 신약 개발, 진단 및 생물 공학을 포함한 광범위한 응용 분야에 적합한 다중 발현 플랫폼을 사용하는 맞춤형 재조합 단백질 생산 서비스를 제공한다. 당사의 단백질 생산 공정은 벡터 클로닝 서비스에도 사용되는 독점적인 재조합 단백질 발현 벡터를 활용하여 고품질 재조합 단백질의 생산을 위해 고도로 최적화되어 있다. 또한 고객이 제공한 벡터에서 재조합 단백질을 생산할 수도 있다..

We offer recombinant protein production based on the following expression platforms:
  • Bacteria
  • Yeast
  • Mammalian cells
  • Insect cells

Service Details

Highlights
  • 연구 목표를 달성하기 위해 다양한 발현 플랫폼 중에서 선택 가능한 유연성을 갖춘 종합적인 단백질 생산 서비스
  • Enzymes, cytokines, receptors, antibodies등 다양한 단백질의 최적화 및 생산에 대한 폭넓은 경험
  • 벡터 클로닝부터 단백질 정제까지 전반적인 단백질 생산 워크플로우를 위한 원스톱 솔루션
  • 특정 프로젝트 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 purification 또는 detection tags를 추가할 수 있는 옵션
  • 다양한 chromatography 및 filtration 기반 기술을 포함하여 고순도를 보장하기 위한 다양한 purification 옵션 사용 가능
  • 요청 시 Post-purification 서비스 가능(예: desalting, aliquoting, endotoxin removal, aseptic process 및 lyophilization)
Price and turnaround

다양한 재조합 단백질 발현 시스템의 서비스 가격과 소요 시간은 Table 1에 나와 있다.

Table 1. Price and turnaround for recombinant protein production.

Recombinant Protein Expression system Available Services Deliverable Typical Yield Price Turnaround
Bacteria (E. coli)* Pilot study
  • Pilot expression report with gel-blot images
  • Crude extracts (optional)
>1 mg,
85% purity
From $300 1-2 weeks
Optimizing protein expression (optional)
  • Optimization data and protocol
From $500 4-6 weeks
Scale-up protein expression and purification (up to 20 L)
  • Purified protein**
  • Detailed protein expression report
From $750 2-3 weeks
Yeast (S. cerevisiae) Pilot study
  • Pilot expression report with gel-blot images
  • Crude extracts (optional)
>1 mg,
85% purity
From $450 1-2 weeks
Optimizing protein expression (optional)
  • Optimization data and protocol
From $600 4-6 weeks
Scale-up protein expression and purification (up to 20 L)
  • Purified protein**
  • Detailed protein expression report
From $900 2-3 weeks
Mammalian cells (293T) Pilot study
  • Pilot expression report with gel-blot images
  • Crude extracts (optional)
1-100 mg/L, 85% purity From $800 3-4 weeks
Optimizing protein expression (optional)
  • Optimization data and protocol
From $1500 3-4 weeks
Scale-up protein expression and purification (up to 1 L)
  • Purified protein**
  • Detailed protein expression report
Please inquire Please inquire
Insect cells (Sf9) Pilot study
  • Pilot expression report with gel-blot images
  • Crude extracts (optional)
1-150 mg/L, 85% purity From $800 6-7 weeks
Optimizing protein expression (optional)
  • Optimization data and protocol
From $1700 6-7 weeks
Scale-up protein expression and purification (up to 1 L)
  • Purified protein**
  • Detailed protein expression report
Please inquire Please inquire

*박테리아 세포에서의 발현의 경우, 재조합 단백질이 inclusion body로 발현되는 경우는 단백질 회수를 위해 추가 비용과 소요시간이 적용될 수 있다.

**정제된 단백질은 기본적으로 -80°C에서 단백질의 장기 보관에 적합한 50% glycerol을 함유한 PBS(pH 7.4)로 배송됩니다. 그러나 별도 요청시 특정 단백질 또는 특정 다운스트림 응용에 필요할 수 있는 다른 storage buffer에 단백질을 보관하여 배송할 수도 있다.

위에서 설명한 서비스 외에도 Table 2에 설명된 다음과 같은 post-purification 서비스를 제공한다.

Table 2. Price and turnaround for additional services.

Available Services Price Turnaround
Western blot* $150/run 2-4 days
Endotoxin testing and removal (< 1.0 EU/mg) $150/sample 5-7 days
Purification tag removal (e.g. His, MBP, GST) $150/sample 5-7 days

* 데이터베이스에서 사용 가능한 표준 fusion tags를 기반으로 하는 Western blots의 경우 항체는 VectorBuilder에서 제공된다. 그러나 데이터베이스에서 사용할 수 없는 비표준 tags의 경우 고객이 보유한 항체를 제공해야 될 수도 있다.

Customers-supplied materials

고객이 제공하는 벡터가 필요한 경우 "서포트" > "시료 제출 양식"에 시료 정보를 제출해 주세요. 시료의 지연이나 손상을 방지하기 위해, 당사의 가이드라인을 엄격히 준수해 주시기 바랍니다. 고객이 제공한 모든 시료는 VectorBuilder의 필수 QC를 거치며, 시료의 타입이나 용도에 따라 시료당 $120부터 추가 QC 요금이 발생할 수 있다. 고객 제공 시료가 QC를 통과할 때까지 생산을 시작할 수 없다.

Technical Information

Bacteria

E. coli는 짧은 doubling time, 기술적 단순성, 확장성 및 낮은 생산 비용을 포함하여 몇 가지 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 호스트이다. VectorBuilder는 cytoplasmic, periplasmic및 soluble, insoluble단백질의 발현을 위해 고도로 최적화된 워크플로우를 사용하여 E. coli에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 한다. 또한 요청 시 B. subtilis에서 재조합 단백질을 생성할 수 있다.

단백질 생산 공정은 fusion partner selection, purification tag selection 및codon optimization을 포함한 컨스트럭스 디자인에서부터 시작된다. 이어 유전자 합성 및 박테리아 재조합 단백질 발현 벡터를 클로닝 한다. 그 다음 벡터를 적절한 박테리아 호스트 균주로 형질전환하고 small-batch fermentation을 하여 단백질 발현을 평가한다. 발현 평가를 기반으로 large-batch fermentation을 하고, 단백질 정제를 수행한다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_E._coli

Figure 1. Typical workflow of recombinant protein production in E. coli.

Yeast

효모를 재조합 단백질 발현 호스트로 활용하면 진핵생물 단백질이 적절한 기능에 필수적인 많은 post-translational modification과 함께 생산될 수 있으며(예: 치료용 단백질의 glycosylation은 면역 반응을 유발할 위험을 감소시킬 수 있음), 다른 진핵생물 단백질 발현 시스템에 비해 생산 비용이 저렴하다. 효모 발현 시스템의 다른 장점은 빠른 발현, 확장성 및 기술적 단순성을 포함한다. VectorBuilder는 secretory 및 intracellular단백질의 발현을 위해 고도로 최적화된 워크플로우를 통해 S. cerevisiae에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 한다. 또한 요청 시 P. pastoris에서 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

단백질 생산 공정은 fusion partner selection, purification tag selection 및codon optimization을 포함한 컨스트럭스 디자인에서부터 시작된다. 이어 유전자 합성 및 효모 재조합 단백질 발현 벡터를 클로닝 한다. 그 다음 벡터를 적절한 효모 균주에 electroporation하고, 높은 생산자를 식별하기 위해 유전적으로 안정한 클론을 스크리닝한다. 이후 small-batch fermentation 을 하여 단백질 발현을 평가한 다음, large-batch fermentation 및 후속 단백질 정제를 수행한다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_yeast.jpg

Figure 2. Typical workflow of recombinant protein production in yeast.

Mammalian cells

Mammalian cell에서 재조합 단백질을 생산하면 모든 중요한 post-translational modification과 적절한 folding을 통해 단백질이 가장 자연적인 상태로 발현될 수 있다. 따라서 치료용 단백질, 백신 및 항체를 생산하는 데 선호되는 접근 방식이다. VectorBuilder는 secretory 및 membrane 단백질의 발현을 위해 고도로 최적화된 transient transfection 플랫폼을 사용하여 HEK293T 세포에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 한다. 또한 요청 시 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

단백질 생산 공정은 fusion partner selection, purification tag selection 및codon optimization을 포함한 컨스트럭스 디자인에서부터 시작된다. 이어 유전자 합성, mammalian 재조합 단백질 발현 벡터 클로닝 및 HEK293T 세포로 transfection한다. 단백질 발현을 평가하기 위해 small-batch transfection이 수행된다. 발현 평가를 기반으로 large-batch transfection을 수행한 후 단백질 정제를 수행한다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_mammalian_cells.jpg

Figure 3. Typical workflow of recombinant protein production in mammalian cells.

Insect cells

타겟 유전자를 발현하는 baculovirus로 고밀도 곤충 세포 배양에 infection하는 것은 eukaryotic post-translational modification및 단백질 folding의 대부분을 유지하면서 재조합 단백질을 생산하기 위해 널리 사용되는 또 다른 접근법이다. 이는 kinases 및 steroid receptor를 생산하는 데 선호되는 접근 방식으로, 박테리아 세포에서 생산하는 경우에는 적절한 phosphorylation이 부족하거나 misfolding으로 비활성 상태가 된다. VectorBuilder는 secretory, membrane 및 intracellular 단백질의 발현을 위해 고도로 최적화된 워크플로우를 통해 Sf9 곤충 세포에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 한다.

단백질 생산 공정은 fusion partner selection, purification tag selection 및codon optimization을 포함한 컨스트럭스 디자인에서부터 시작된다. 이어 유전자 합성, baculovirus transfer 벡터를 클로닝하고, 재조합 bacmid를 생성한다. 이어 재조합 bacmid를 곤충 세포로 transfection시켜 재조합 baculovirus를 생성한 후 증폭한다. 단백질 발현을 평가하기 위해 small-batch transfection이 수행됩니다. 발현 평가를 기반으로 large-batch transfection을 수행한 후 단백질 정제를 수행한다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_insect_cells.jpg

Figure 4. Typical workflow of recombinant protein production in insect cells.

Quality control

VectorBuilder에서 생산된 모든 단백질은 엄격한 품질 관리를 거치며, 오염 물질이 없고 디자인한 대로 정확한 서열을 포함한다. 일반적인 QC에는 SEC-MALS(combination of size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering)에 의한 단백질의 분자량과 사이즈 확인 및 SDS-PAGE에 의한 단백질 순도 측정이 포함된다. 요청 시 Western blot도 수행할 수 있다.

How to Order

FAQ

Which recombinant protein expression system should I choose?

All recombinant protein expression systems have their own advantages and disadvantages which should be taken into consideration while selecting the optimal system suitable for your project. The table below summarizes the pros and cons of each system.

Recombinant protein expression system Pros Cons
Bacteria
  • Cost-effective.
  • Short production time.
  • Technically simple.
  • Can be scaled up easily.
  • High protein yield.
  • Proteins lack post-translational modifications.
  • Codon usage is different from that of eukaryotes.
  • Difficult to express certain proteins due to solubility issues.
  • Accumulation of inclusion bodies making protein purification difficult.
  • Some proteins are toxic and can inhibit bacterial growth.
Yeast
  • Cost-effective.
  • Short production time.
  • Technically simple.
  • Can be scaled up easily.
  • High protein yield.
  • Incorporates some post-translational modifications such as N-glycosylation, phosphorylation, etc.
  • Suitable for secretory as well as intracellular proteins.
  • Hyper-glycosylation of proteins.
  • Glycosylation pattern is different from that of higher eukaryotes.
  • Presence of large quantities of mannose in N-glycan structures.
Mammalian cells
  • Produces proteins in their most natural state with all necessary post-translation modifications and proper folding.
  • Suitable for secretory and membrane proteins.
  • Most appropriate for producing therapeutic proteins.
  • High production cost.
  • Long production time.
  • Requires complex growth conditions.
  • Scaling up can be difficult.
  • Not suitable for intracellular proteins due to low yield.
Insect cells
  • Performs majority of complex post-translational modifications and protein folding.
  • Suitable for secretory, intracellular, and membrane proteins.
  • Can be used for producing large protein complexes.
  • High levels of protein expression compared to other eukaryotic expression systems.
  • Produced in high-density, suspension cultures making it highly scalable.
  • High production cost.
  • Long production time.
  • Requires complex growth conditions.
  • Technically challenging.
Why is my bacterial vector not expressing my recombinant protein?

박테리아에서 재조합 단백질을 발현하는데 문제가 있을 수 있는 몇 가지 일반적인 이유를 아래에 기재하였다.

The plasmid is placed in an inappropriate host strain

Plasmid는 induction에 부적절한 호스트 균주에서 발현되지 않을 수 있다. VectorBuilder의 대부분의 벡터는 클로닝 호스트 균주로 VB UltraStable™을 사용한다. VB UltraStable™은 plasmid의 안정성을 유지하는 능력으로 인해 선호되는 클로닝 호스트이지만 재조합 단백질 발현에는 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, pET의 경우 IPTG 유도 재조합 단백질 발현은 호스트 균주에서 발현되는 T7 RNA polymerase (VB UltraStable 에는 없음)를 필요로 한다. 이와 같이, 박테리아 발현 벡터는 일반적으로 적절한 induction을 위해 plasmid로 BL21(DE3)과 같은 적절한 호스트 균주로 형질전환해야 한다.

The protein expressed on the vector is “problematic”

때때로 발현되는 단백질이 insoluble, misfolding, 잘못 절단되거나 박테리아 호스트에 독성이 있는 경우 재조합 단백질의 induction이 좋지 못한 것으로 나타날 수 있다. 이 경우 induction 시스템(아래 참조)을 최적화하거나 더 내성이 있는 호스트 균주 또는 대체할 수 있는 발현 시스템에서 유전자를 발현해야 한다.

Your induction system is not optimized

발현할 유전자, 발현 벡터 및 호스트 균주에 따라 induction 시스템에서 다음 사항을 최적화하는 것을 고려해야 할 수 있다. OD600(일반적으로 0.6~0.8); inducing agent (예: IPTG 또는 L- arabinose)의 농도는 너무 낮거나 너무 높아서는 안 된다. induction 지속시간은 너무 짧거나 너무 길어서는 안 된다. Induction 온도는 특히 "문제가 있는" 단백질을 다룰 때 최적화해야 하며(위 참조) 다양한 온도에서 테스트할 수 있다(예: 16°C, 25°C, 30°C, 37°C 등). 드문 경우지만 알 수 없는 이유로 동일한 발현 벡터의 서로 다른 클론이 다른 induction 동작을 보일 수 있으므로 개별적으로 테스트할 단일 콜로니를 여러개 선택하고 유도 성능이 가장 좋은 콜로니를 선택해야 한다.

위에서 설명한 문제가 발생하지 않도록 하고 실제 연구를 위한 귀중한 시간을 절약하려면, VectorBuilder에 재조합 단백질 발현을 아웃소싱하면 된다.