재조합 단백질 생산 (Recombinant Protein Production)

VectorBuilder는 단백질 구조 분석, 효소를 이용하는 assay 개발, 신약 개발, 진단 및 생물 공학을 포함한 광범위한 응용 분야에 적합한 맞춤형 재조합 단백질을 여러 가지 발현 플랫폼을 이용하여 생산하는 서비스를 제공합니다. 당사의 단백질 생산 공정은 벡터 클로닝 서비스에서도 사용되는 당사 소유의 재조합 단백질 발현 벡터를 사용하여 고품질 재조합 단백질의 생산을 위해 고도로 최적화되어 있습니다. 또한 고객이 제공하는 벡터로 재조합 단백질을 생산할 수도 있습니다.

VectorBuilder에서는 다음과 같은 발현 플랫폼을 이용하여 재조합 단백질 생산이 가능합니다:
  • 박테리아
  • 효모
  • 포유류 세포
  • 곤충 세포

서비스 세부 사항

서비스의 중점
  • 연구 목표를 달성하기 위해 다양한 발현 플랫폼 중에서 선택 가능한 유연성을 갖춘 종합적인 단백질 생산 서비스를 제공합니다.
  • 효소, cytokines, receptors, 항체 등 다양한 단백질의 최적화 및 생산에 대한 폭넓은 경험을 보유하고 있습니다.
  • 벡터 클로닝부터 단백질 정제까지 전반적인 단백질 생산 워크플로우를 위한 원스톱 솔루션을 제공합니다.
  • 특정 프로젝트 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 purification 또는 detection tags를 추가할 수 있는 옵션을 제공합니다.
  • 다양한 chromatography 및 filtration 기반 기술을 포함하여 고순도를 보장하기 위한 다양한 정제 옵션을 제공합니다.
  • 요청 시 Post-purification 서비스 (예: desalting, aliquoting, endotoxin 제거, aseptic process 및 lyophilization) 를 제공합니다.
가격 및 소요 시간

다양한 재조합 단백질 발현 시스템의 서비스 가격과 소요 시간은 Table 1에 나와 있습니다.

Table 1. 재조합 단백질 생산을 위한 가격 및 소요시간.

Recombinant Protein Expression system Available Services Deliverable Typical Yield Price Turnaround
Bacteria (E. coli)*** Pilot study*
  • 파일럿 발현 결과가 SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
>1 mg,
85% 순도
From $300 1-2 주
Optimizing protein expression (optional)
  • 최적화 실험 방법과 결과가  SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
From $500 4-6 주
Scale-up protein expression and purification (up to 20 L)
  • 정제된 단백질****
  • 구체적인 단백질 발현 보고서
From $750 2-3 주
Yeast (S. cerevisiae) Pilot study*
  • 파일럿 발현 결과가 SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
>1 mg,
85% 순도
From $450 1-2 주
Optimizing protein expression (optional)
  • 최적화 실험 방법과 결과가  SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
From $600 4-6 주
Scale-up protein expression and purification (up to 20 L)
  • 정제된 단백질****
  • 구체적인 단백질 발현 보고서
From $900 2-3 주
Mammalian cells (293T) Pilot study*
  • 파일럿 발현 결과가 SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**

1-100 mg/L, 85% 순도

From $800 3-4 주
Optimizing protein expression (optional)
  • 최적화 실험 방법과 결과가  SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
From $1500 3-4 주
Scale-up protein expression and purification (up to 1 L)
  • 정제된 단백질****
  • 구체적인 단백질 발현 보고서
문의해주시기 바랍니다 문의해주시기 바랍니다
Insect cells (Sf9) Pilot study*
  • 파일럿 발현 결과가 SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
1-150 mg/L, 85% 순도 From $800 6-7 주
Optimizing protein expression (optional)
  • 최적화 실험 방법과 결과가  SDS-PAGE와 western blot 이미지와 함께 제공됩니다**
From $1700 6-7 주
Scale-up protein expression and purification (up to 1 L)
  • 정제된 단백질****
  • 구체적인 단백질 발현 보고서
문의해주시기 바랍니다 문의해주시기 바랍니다

* Pilot study 비용에는 재조합 단백질 발현 벡터의 클로닝 비용이 포함되어 있지 않습니다. 보유하고 계신 벡터를 보내주시거나, 디자인 의뢰하기를 보내주시면 VectorBuilder의 전문가들이 벡터를 디자인하고 클로닝할 수 있습니다. 파일럿 연구에서 얻은 crude extracts는 요청시 제공할 수는 있지만 장거리 운송 중에 분해가 일어날 수 있습니다. 

** VectorBuilder의 데이터베이스에서 사용 가능한 표준 fusion tag들을 사용하는 경우 western blots에 사용되는 항체는 VectorBuilder에서 제공됩니다. 그러나 저희 데이터베이스에 없는 비표준 tag의 경우 저희의 요청에 따라 고객이 자체의 항체를 제공해야 할 수도 있습니다.

*** 박테리아 세포에서 발현하는 경우, 재조합 단백질이 inclusion body로 발현되는 경우에는 단백질 회수를 위한 추가 비용 및 소요시간이 적용될 수 있습니다.

**** 정제된 단백질은 기본적으로 -80°C에서 단백질의 장기 보관에 적합한 50% glycerol을 함유한 PBS (pH 7.4)에 용해된 상태로 배송됩니다. 그러나 고객의 요청시에 특정 단백질 또는 특정 용도에 적절한 다른 storage buffer을 사용하여 배송할 수도 있습니다.

위에서 설명한 서비스 외에도 Table 2에서와 같은 post-purification 서비스도 추가로 제공합니다.

Table 2. 추가 서비스의 가격 및 소요 시간.

Available Services Price Turnaround
Endotoxin testing and removal (< 1.0 EU/mg) $150/sample 5-7 일
Purification tag removal (e.g. His, MBP, GST) $150/sample 5-7 일

고객이 제공하는 벡터

고객이 제공하는 벡터가 필요한 경우 "서포트" > "시료 제출 양식"에 따라서 벡터를 보내주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며, 시료의 타입이나 용도에 따라 시료당 $120이상의 추가 QC 요금이 부과될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다.

기술적인 정보

박테리아

E. coli는 짧은 doubling time, 기술적 단순성, 확장성 및 낮은 생산 비용을 포함하는 여러 가지 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 호스트입니다. VectorBuilder는 cytoplasmic, periplasmic 및 soluble, insoluble단백질의 발현을 위해 고도로 최적화된 워크플로우를 사용하여 E. coli를 이용하는 재조합 단백질 생산을 전문으로 합니다. 또한 요청에 따라 B. subtilis에서 재조합 단백질을 생성할 수 있습니다.

단백질 생산 공정은 fusion partner 선택, purification tag 선택 및 codon 최적화를 포함한 벡터 디자인에서부터 시작됩니다. 이어 유전자를 합성하여 박테리아용 재조합 단백질 발현 벡터에 클로닝합니다. 그 다음 벡터를 적절한 박테리아 호스트 균주로 형질전환하고 소규모 배양을 통하여 단백질 발현을 평가합니다. 소규모에서의 발현 평가를 기반으로 대규모로 배양을 하고, 단백질 정제를 수행합니다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_E._coli

Figure 1. E. coli를 이용한 재조합 단백질 생산의 일반적인 워크플로우.

효모

효모를 재조합 단백질 발현 호스트로 활용하면 진핵생물 단백질의 적절한 기능에 필수적인 여러 post-translational modification이 된 상태로 생산될 수 있으며 (예: 치료용 단백질의 glycosylation은 면역 반응을 유발할 위험을 감소시킬 수 있음), 다른 진핵생물 단백질 발현 시스템에 비해 생산 비용이 저렴합니다. 효모 발현 시스템의 다른 장점은 빠른 발현, 확장성 및 기술적 단순성입니다. VectorBuilder는 세포 외로 분비되거나 및 세포 내에 존재하는 단백질들의 발현을 위하여 고도로 최적화된 워크플로우를 통해 S. cerevisiae에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 합니다. 또한 요청에 따라 P. pastoris에서 재조합 단백질을 생산할 수도 있습니다.

단백질 생산 공정은 fusion partner 선택, purification tag 선택 및 codon 최적화를 포함한 벡터 디자인에서부터 시작됩니다. 이어 유전자를 합성하여 효모용 재조합 단백질 발현 벡터에 클로닝합니다. 그 다음 벡터를 적절한 효모 균주에 electroporation하고 발현이 높은 안정한 클론을 스크리닝합니다. 소규모 배양을 통하여 단백질 발현을 평가하고, 그 결과에 따라 대규모로 배양을 한 후 단백질 정제를 수행합니다. 

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_yeast.jpg

Figure 2. 효모를 이용한 재조합 단백질 생산의 일반적인 워크플로우.

포유류 세포

포유류 세포에서 재조합 단백질을 생산하면 모든 중요한 post-translational modification이 되며 적절한 folding에 의해 단백질이 가장 자연적인 상태로 발현될 수 있습니다. 따라서 치료용 단백질, 백신 및 항체를 생산하는 데 선호되는 발현 방법입니다. VectorBuilder는 분비되거나 세포막에 존재하는 단백질의 발현을 위하여 고도로 최적화된 transient transfection 플랫폼을 사용하여 HEK293T 세포에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 합니다. 또한 요청에 따라 CHO 세포에서 재조합 단백질을 생산할 수도 있습니다.

단백질 생산 공정은 fusion partner 선택, purification tag 선택 및 codon 최적화를 포함한 벡터 디자인에서부터 시작됩니다. 이어 유전자를 합성하여 포유류 세포용 단백질 발현 벡터에 클로닝하고, 벡터를 HEK293T 세포에 transfection합니다. 소규모의 transfection을 통하여 단백질 발현을 평가하고, 그 결과에 따라 대규모로 transfection을 한 후 단백질 정제를 수행합니다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_mammalian_cells.jpg

Figure 3. 포유류 세포를 이용한 재조합 단백질 생산의 일반적인 워크플로우.

곤충 세포

타겟 유전자를 발현하는 baculovirus로 고밀도 곤충 세포 배양에 infection하는 방법은 대부분의 진핵 생물 post-translational modification 및 단백질 folding이 되어 있는 재조합 단백질을 생산하기 위해 널리 사용되는 또 다른 방법입니다. 이는 kinase 및 steroid receptor를 생산하는 데 선호되는 방법으로, 박테리아 세포에서 생산하는 경우에는 kinase의 경우 적절한 phosphorylation이 안되어 있고 steroid receptor의 경우 misfolding으로 인하여 비활성 상태로 발현이 됩니다. VectorBuilder는 발현 후에 세포내에 존재하거나, 세포막에 존재하거나, 분비되는 단백질들의 발현을 위해 고도로 최적화된 워크플로우를 통해 Sf9 곤충 세포에서 재조합 단백질 생산을 전문으로 합니다.

단백질 생산 공정은 fusion partner 선택, purification tag 선택 및 codon 최적화를 포함한 벡터 디자인에서부터 시작됩니다. 이어 유전자를 합성하여 baculovirus transfer 벡터에 클로닝하고, 재조합 bacmid를 생성합니다. 이어 재조합 bacmid를 곤충 세포로 transfection하여 재조합 baculovirus를 생성한 후 증폭합니다. 소규모의 transfection을 통하여 단백질 발현을 평가하고, 그 결과에 따라 대규모로 transfection을 한 후 단백질 정제를 수행합니다.

Typical_workflow_of_recombinant_protein_production_in_insect_cells.jpg

Figure 4. 포유류 세포를 이용한 재조합 단백질 생산의 일반적인 워크플로우.

품질 관리

VectorBuilder에서 생산되는 모든 단백질은 엄격한 품질 관리를 통하여 디자인한 대로 정확한 서열을 가지고 있고, 오염 물질이 없으며, 고객의 프로젝트에서 요구하는 조건을 만족시키는지를 확인하는 과정을 거칩니다. 기본적인 QC에는 1) 제한 효소 분석과 Sanger sequencing에 의한 단백질 발현 벡터 검증, 2) SDS-PAGE와 A260/280 측정에 의한 단백질 순도 확인 과정이 포함됩니다. 요청 시에 western blot, endotoxin asay, mass spectometry 및 SEC-MALS (combination of size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering)에 의한 추가 분석들이 가능합니다.

주문 방법

자주 묻는 질문

어떤 재조합 단백질 발현 시스템을 선택하는 것이 좋을까요?

프로젝트에 적합한 최적의 시스템을 선택할 때 각각의 재조합 단백질 발현 시스템의 고유한 장점과 단점들을 고려해야 합니다. 아래의 표는 각 시스템의 장단점을 요약한 것입니다.

재조합 단백질

발현 시스템

장점 단점
박테리아
  • 비용면에서 효율적입니다.
  • 생산 시간이 짧습니다.
  • 기술적으로 단순합니다.
  • 생산 규모 확장이 쉽습니다.
  • 단백질 수율이 높습니다.
  • 단백질들에 post-translational modification이 되지 않습니다.
  • 진핵 생물들과 다른 코돈을 사용합니다.
  • 용해도 (solubility) 문제에 의하여 몇몇 단백질은 발현이 어렵습니다.
  • Inclusion body로 만들어지는 경우 단백질 정제가 어렵습니다.
  • 어떤 단백질들은 독성이 있어서 박테리아의 생장을 저해합니다.
효모
  • 비용면에서 효율적입니다.
  • 생산 시간이 짧습니다.
  • 기술적으로 단순합니다.
  • 생산 규모 확장이 쉽습니다.
  • 단백질 수율이 높습니다.
  • 발현되는 단백질에 N-glycosylation, phosphorylation 등의 몇몇 post-translational modifications이 가능합니다.
  • 세포내 단백질 뿐 아니라 분비용 단백질 생산에도 적합합니다.
  • 단백질에 glycosylation이 너무 많이 일어날 수 있습니다.
  • Glycosylation pattern이 고등 진핵 세포와 다릅니다.
  • N-glycan 구조 내에 있는 mannose 함량이 높습니다.
포유류 세포
  • 단백질들이 자연 상태에 가장 가까운 post-translation modifications을 가지고 적절히 folding된 상태로 생성됩니다.
  • 분비되거나 세포막에 존재하는 단백질의 발현에 적합합니다.
  • 치료용 단백질들을 생산하는데 가장 적합합니다.
  • 생산 비용이 높습니다.
  • 생산 시간이 오래 걸립니다.
  • 복잡한 배양 조건이 요구됩니다.
  • 생산 규모 확장이 어려울 수 있습니다.
  • 세포내 단백질의 경우 수율이 낮아서 부적합합니다.
곤충 세포
  • 단백질들이 대부분의 복잡한 post-translation modifications을 가지고 적절히 folding된 상태로 생성됩니다.
  • 분비되거나 세포내 또는 세포막에 존재하는 단백질의 발현에 적합합니다.
  • 큰 단백질 복합체를 만드는데 사용될 수 있습니다.
  • 다른 진핵세포 발현 시스템에 비하여 높은 수준의 단백질 발현이 가능합니다.
  • 고밀도의 현탁배양 (suspension culture) 으로 생산 규모 확장이 쉽습니다.
  • 생산 비용이 높습니다.
  • 생산 시간이 오래 걸립니다.
  • 복잡한 배양 조건이 요구됩니다.
  • 기술적인 어려움이 있을 수도 있다.
왜 나의 박테리아 발현용 벡터에서 재조합 단백질이 발현되지 않을까요?

박테리아에서 재조합 단백질을 발현하는데 문제가 있을 수 있는 몇 가지 일반적인 이유는 다음과 같습니다.

Plasmid가 부적절한 호스트 균주에 들어 있습니다.

Plasmid는 발현 유도에 부적절한 호스트 균주에서는 발현되지 않을 수 있습니다. VectorBuilder의 대부분의 벡터는 클로닝 호스트 균주로 VB UltraStable™을 사용합니다. VB UltraStable™은 plasmid의 안정성을 유지하는 능력으로 인해 선호되는 클로닝 호스트이지만 재조합 단백질 발현에는 적합하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, pET 계열의 벡터들은 IPTG 유도 재조합 단백질 발현은 호스트 균주에서 발현되는 T7 RNA polymerase를 필요로 하는데, VB UltraStable™에는 이 효소가 없습니다. 이러한 경우, 박테리아 발현 벡터는 일반적으로 적절한 발현 유도를 위해 BL21(DE3)와 같은 이 목적에 적합한 호스트 균주로 옮겨야 합니다.

벡터로부터 발현되는 단백질에 문제가 있습니다.

때때로 발현되는 단백질이 불용성이거나, folding이 제대로 안되거나, 잘못 절단되거나, 박테리아 호스트에 독성이 있는 경우 재조합 단백질의 유도 발현이 잘 안되는 원인이 될 수 있습니다. 이 경우 발현 유도 시스템 (아래 참조) 을 최적화하거나 더 내성이 있는 박테리아 호스트 균주 또는 다른 발현 시스템을 사용해야 합니다.

발현 유도 시스템이 최적화 되지 않았습니다.

발현할 유전자, 발현 벡터 및 호스트 균주에 따라 발현 유도 시스템에서 다음 사항들을 최적화할 필요가 있습니다. 발현 유도를 시작하는 OD600(일반적으로 0.6~0.8)이 적절해야 합니다. 발현 유도제 (예: IPTG 또는 L- arabinose) 의 농도는 너무 낮거나 너무 높아서는 안 됩니다. 발현 유도 지속시간은 너무 짧거나 너무 길어서는 안 된다. 특히 "문제가 있는" 단백질을 다룰 때 발현 유도 온도를 최적화할 필요가 있으며 (위 참조), 16°C, 25°C, 30°C, 37°C 등 다양한 온도에서 테스트해보는 것이 좋습니다. 드문 경우지만 알 수 없는 이유로 동일한 발현 벡터의 서로 다른 클론에 따라 발현 유도에 차이가 있을 수 있으므로, 개별적으로 시험할 여러 개의 콜로니를 선택하고 그 중에서 발현 유도 성능이 가장 좋은 콜로니를 선택해야 합니다.

위에서 설명한 문제들을 피하고 실제 연구를 위한 귀중한 시간을 절약하려면, VectorBuilder에 재조합 단백질 발현을 아웃소싱하시면 됩니다.