Rabies Virus (RABV)
재조합 광견병 바이러스(RV 또는 RABV, rabies virus)는 연구자들이 바이러스에서 발견되는 독특한 감염 메커니즘을 활용하여 신경망과 백신 개발에 대한 연구를 발전시키고 있습니다. 광견병은 특정 신경영양성, 제한된 시냅스 간 확산, 표적 세포 지정 능력, 유전체 integration 결핍이라는 장점이 있습니다.
제공히는 RABV 서비스 유형
- CVS-N2c 또는 HEP-Flury 백본을 사용한 RABV 벡터 클로닝
- G protein (N2cG 또는 B19G) 또는 EnvA로 pseudotyped된 RABV 패키징
서비스 상세
VectorBuilder는 재조합 RABV를 클로닝하기 위해 2가지 다른 strain에서 백본을 개발했습니다. CVS-N2c는 주로 synaptic tracing에 사용되고, HEP-Flury는 백신 개발에 사용됩니다. Strain 선택에 대한 자세한 내용은 FAQ를 참조하세요. CVS-N2c 백본에는 glycoprotein G를 제외한 RABV 게놈의 모든 활성 유전자가 포함됩니다. EGFP 또는 mCherry는 일반적으로 G 단백질 대신 클로닝되지만, 고도로 약독화된 HEP-Flury strain의 경우 G 단백질을 포함한 모든 활성 광견병 유전자가 있는 벡터를 제공할 수 있으며, 여기서 마커는 G와 L 유전자 사이에 클로닝됩니다. 커스텀 벡터가 필요한 경우 VectorBuilder에 문의하시면 디자인 서포트를 도와드리고 있습니다.
Figure 1. (A) RABV 게놈의 N, P, M 및 L 유전자를 포함하는 RABV CVS-N2c 백본. (B) RABV 게놈의 N, P, M, G 및 L 유전자를 포함하는 RABV HEP-Flury 백본.
CVS strain
HEP-Flury strain
가격 및 소요시간 Price Match
| Scale | Application | Titer | Volume | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|---|---|
| RABV pseudotyped with SAD-B19G (EGFP or mCherry) | |||||
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >108 FFU/ml | 100 ul (10x10 ul) | $899 | Please inquire |
| Ultra-purified medium | 250 ul (25x10 ul) | $1,399 | |||
| RABV pseudotyped with N2cG (EGFP or mCherry) | |||||
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >108 FFU/ml | 100 ul (10x10 ul) | $1,199 | Please inquire |
| Ultra-purified medium | 250 ul (25x10 ul) | $2,399 | |||
| RABV pseudotyped with EnvA (EGFP or mCherry) | |||||
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >108 FFU/ml | 100 ul (10x10 ul) | $1,599 | Please inquire |
| Ultra-purified medium | 250 ul (25x10 ul) | $3,099 | |||
| RABV pseudotyped with SAD-B19G, CVS-N2c, or EnvA expressing custom GOl | |||||
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >108 FFU/ml | 100 ul (10x10 ul) | Please inquire | |
| Ultra-purified medium | 250 ul (25x10 ul) | ||||
Helper 바이러스
Synaptic tracing에는 rabies 바이러스와 rabies G protein을 발현하는 helper virus의 transduction이 필요합니다. EnvA-pseudotyped rabies의 경우 TVA 발현도 필요합니다. 자세한 내용은아래에서 확인할 수 있습니다.
가격 및 소요시간 Price Match
| Scale | Application | Titer | Volume | Price (USD) | Turnaround |
|---|---|---|---|---|---|
| RABV expressing EGFP or mCherry | |||||
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >108 FFU/ml | 100 ul (10x10 ul) | $899 | Please inquire |
| Ultra-purified medium | 250 ul (25x10 ul) | $1,399 | |||
| RABV expressing custom GOl | |||||
| Ultra-purified pilot | Cell culture & in vivo | >108 FFU/ml | 100 ul (10x10 ul) | Please inquire | |
| Ultra-purified medium | 250 ul (25x10 ul) | ||||
배송 및 보관
Rabies바이러스를 배송하려면 특정 허가가 필요합니다. 도움이 필요하면 연락 주시기 바랍니다. RABV는 HBSS 버퍼에 보관하고, 드라이아이스에 담아 배송합니다. 수령 즉시 장기 보관을 위해서는 -80°C (최소 6개월 이상 안정) 또는 1주일 이내에 사용하려면 -20°C에 보관해야 합니다. RABV의 shelf life는 약 1년입니다. RABV의 반복적인 동결-융해는 심각한 titer 감소를 초래할 수 있기 때문에 피해야 합니다.
Ultra-purified AAV는 PBS-based buffer에 보관됩니다. 모든 AAV는 드라이아이스에 담겨 배송됩니다. 수령 즉시 장기 보관을 위해서는 -80°C (최소 1년 이상 안정)에서 보관해야 하며, 단기적으로는 -20°C(예: 2-3주)에서 보관해야 합니다. 해동된 AAV 바이러스는 4°C에서 1-2주 동안 보관할 수 있습니다. AAV는 다른 많은 바이러스(예: 렌티바이러스) 보다 안정적이며 바이러스 활성을 최소한으로 손실하면서 여러번 동결 및 해동할 수 있지만, 실제로는 반복적인 동결-융해 주기를 피하는 것이 가장 좋습니.
기술적인 정보
RABV 생산 및 QC
CVS-N2c strain의 바이러스 패키징 (Figure 2)을 위해, GOI를 운반하는 plasmid와 RABV 유전자 G, N, P, L을 포함하는 helper plasmid를 바이러스 전사를 위한 T7 RNA Polymerase helper plasmid와 함께 패키징 세포에 co-transfection 합니다. Packaging plasmid에서 생성된 바이러스 단백질은 transfer plasmid에 바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 입자의 조립에 필요합니다. G-complemented RABV를 생성한 후, 바이러스는 G protein을 안정적으로 발현하는 세포를 사용하여 증폭됩니다. 특이성을 높이기 위해 EnvA로 pseudotyping할 때, 이러한 패키징 세포에서 수집한 상층액을 EnvA가 안정적으로 발현되는 새로운 세포 디쉬에 적용합니다. 그런 다음 바이러스 입자를 ultracentrifugation하여 정제합니다. Ultra-purified RABV (in vivo grade)의 경우, 바이러스 입자는 sucrose density gradient centrifugation으로 추가 정제하고 농축합니다. RABV titer는 plaque assay를 통해 결정합니다. 아래 워크플로우는 EnvA-pseudotyped RABV에 대한 일반 가이드입니다. HEP-Flury strain의 패키징을 포함하여 추가 정보가 필요하면 VectorBuilder에 문의 하시기 바랍니다.
Figure 2. EnvA-pseudotyped RABV 패키징의 일반적인 워크플로우.
VectorBuilder에서 생산한 각 재조합 RABV에 대해 QC에는 titer 측정, 박테리아 및 진균에 대한 sterility 검사, mycoplasma 검출이 포함됩니다. RABV 벡터가 형광 단백질 또는 drug-selection marker를 인코딩하는 경우 각각 형광 검출 또는 drug selection을 사용한 transduction 테스트를 수행합니다. 또한 ultra-purified RABV의 경우 endotoxin 레벨을 확인하기 위해 정기적으로 endotoxin 분석을 수행합니다. COA에 endotoxin 결과를 포함하려면 추가 비용이 필요합니다. 별도 요청시 추가 QC 서비스를 제공할 수 있습니다.
실험에 의한 검증
- Monosynaptic tracing
- Transduction validation
Figure 3. AAV helper virus expressing TVA:mCherry and Cre-driven rabies G protein were injected into the dorsal medium striatum (DMS) in D1-Cre mice. EnvA-pseudotyped rabies expressing EGFP was then injected in the same region. The animal was perfused 7 days after rabies virus injection. Magnification: 10x (inset 60x). Left: basolateral amygdala. Right: cortex.
293T 293T-TVA
Figure 4. 293T cells (with and without stable expression of TVA) were transduced with RABV particles expressing EGFP and pseudotyped with EnvA. Images were taken at 48 hours post-transduction. Magnification: 100x. Left: bright field. Right: EGFP.
Rabies바이러스 배경 및 주요 응용 분야
RABV는 rhabdovirus 계열에 속하는 negative-strand RNA 바이러스입니다. 게놈 길이는 약 12 kb이고 3-5 kb의 인서트를 통합할 수 있습니다. 이 바이러스는 G glycoprotein을 사용하여 일반적으로 뉴런의 axon terminal에서 발견되는 다양한 receptor를 인식합니다. Axon terminal에 도달하면 바이러스는 역행 방향(retrograde direction)으로 cell body로 이동하여 replication이 일어납니다. 바이러스 replication과 transcription은 cytoplasm에서 발생하여 genomic integration의 위험과 바이러스의 life cycle에 대한 호스트 기구에 대한 의존성을 최소화합니다.
Replication 후 바이러스는 neuron dendrite로 이동하여 budding을 통해 빠져나갑니다. 이 매우 신경 친화적인 바이러스는 chemical synapse를 통해 다른 세포로 퍼져 새로운 axon terminal을 감염시키고 말초 및 중추 신경계를 통해 presynaptic neuron으로 계속 이동합니다.
신경망 설명
재조합 RABV는 신경망의 synaptic tracing에 주로 사용됩니다(Figure 5). Retrograde transport와 시냅스 간 확산 제한으로 인해 RABV를 사용하면 신경 연결의 특정 시각화 및 조절이 가능합니다. 일반적으로 벡터에는 G protein이 없으므로 primary neuron에 감염된 후 바이러스가 다른 세포로 퍼질 수 없습니다. 그러나 바이러스가 G protein 발현 세포(예: AAV transduction을 통해)에 도입되면 기능적 바이러스가 생성되어 상류 secondary neuron으로만 확산되어 monosynaptic tracing이 용이합니다.
종종 특정 neuron subtype의 monosynaptic 연결을 연구하는 것이 필요합니다. 이 경우 EnvA/TVA 시스템은 바이러스 타겟팅을 허용합니다. RABV는 TVA에 특이적으로 결합하는 envelope protein EnvA로 pseudotyped될 수 있으며 TVA와 G protein을 발현하는 벡터는 primary neuron을 표적으로 삼을 수 있습니다. 이렇게 하면 재조합 RABV가 표적 세포에만 감염되고 모든 직접 입력에 대한 monosynaptic tracing이 가능해집니다.
Figure 5. G-pseudotyped 및 EnvA-pseudotyped 재조합 RABV의 디자인, transduction 및 감염.
백신 개발
광견병은 증상이 나타나면 거의 100%의 사망률을 보이는 질병으로, 광견병 백신 개발에 대한 관심이 커지고 있습니다. 현재 불활성화된 RABV가 가장 일반적으로 사용되는 백신이지만, replication-competent 재조합 RABV 기반 백신의 개발이 현재 진행 중입니다. HEP-Flury strain은 높은 약독화, 낮은 병원성 및 높은 면역원성으로 인해 이 응용 분야에 특히 적합합니다.
주문 방법
고객 제공 벡터
고객 제공 RABV 플라스미드를 패키징에 사용하는 경우, 시료 제출 가이드라인에 따라 준비하여 보내주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료의 손상을 방지하기 위해 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객 제공 시료는 VectorBuilder의 필수 QC를 거치며, 각 샘플에 대해 $100의 추가 요금이 부과될 수 있습니다. 고객 제공 시료가 QC를 통과할 때까지 생산을 시작할 수 없습니다.
정보 자료
문서 자료
리플렛
Material Safety Data Sheet (MSDS)
FAQ
RABV is from the same family as VSV but has significant differences: RABV has more specific tropism (neurons only), longer incubation, and absence of cytopathic effects. Its high infectivity specifically in neurons and transsynaptic spread are the primary distinctions for RABV, and further comparisons are listed below.
| Lentivirus | Adenovirus | AAV | VSV | RABV | |
|---|---|---|---|---|---|
| Tropism | Broad | Ineffective for some cells | Depending on viral serotype | Broad | Highly neurotropic |
| Carrying capacity | 6.4 kb | 7.5 kb | 4.2 kb | 4.5 kb | 3-5 kb |
| Can infect non-dividing cells? | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes |
| Stable integration or transient | Stable integration | Transient, episomal | Transient, episomal | Transient, episomal | Transient, episomal |
| Maximum titer | High | Very high | High | High | High |
| Promoter customization | Yes | Yes | Yes | No | No |
| Primary use | Cell culture and in vivo |
In vivo | In vivo | Cell culture and in vivo |
Cell culture and in vivo |
| Immune response in vivo | Low | High | Very low | High | Low |
- CVS-N2c is more highly virulent, has higher neurotropism, and increased efficiency of transmission. This is an ideal strain for synaptic tracing and studying mechanisms of infection over a shorter time frame.
- HEP-Flury is more highly attenuated, is less pathogenic, and induces a higher immune response. This is an ideal strain for vaccine development and longer-term studies.
Recombinant RABV vectors generated by VectorBuilder are attenuated and can be used in Biosafety Level 2 facilities. Of note, import of RABV into the US requires a valid USDA permit, with which we can provide assistance. CVS-N2c strain rabies viruses are replication incompetent because they lack the envelope glycoprotein G gene, so replication is only possible in cells where the G protein is provided in trans. HEP-Flury strain rabies viruses contain the glycoprotein gene but are highly attenuated with low virulence and pathogenicity.